Định lượng Thyroglobuline (Tg) bằng kỹ thuật miễn dịch phóng xạ

Định lượng Thyroglobuline (Tg) bằng kỹ thuật miễn dịch phóng xạ

NGUYÊN LÝ

THYROGLOBULINE IRMA kit là test đo miễn dịch phóng xạ dùng để định lượng nồng độ thyroglobuline (Tg) trong huyết thanh người. Tg, một glycoprotein có iod với trọng lượng phân tử 660.000 là thành phần chính của chất keo có trong nang giáp. Tg đóng một vại trò thiết yếu trong sự sinh tổng hợp, lưu trữ và bài tiết các hormone giáp T₃ và T₄. Nó được tổng hợp chỉ bởi các tế bào TG, bởi vậy nó tạo nên một marker đặc hiệu về sự tồn tại của mô giáp bình thường hoặc mô giáp bệnh lý (ung thư tuyến  giáp tái phát và di căn…). 

Định lượng Tg trong huyết thanh thường được tiến hành cho người bệnh ung thư tuyến giáp thể biệt hoá.Ung thư giáp thể tuỷ và thể không biệt hoá không tiết Tg.Vì vậy không dùng Tg để theo dõi,đánh giá sau điều trị đối với hai loại ung thư này.

THYROGLOBULINE IRMA kit sử dụng kỹ thuật đo miễn dịch phóng xạ với những đặc tính sau đây:

Hỗn hợp 4 KT kháng Tg đơn dòng được lựa chọn theo các tiêu chuẩn xác định về tính đặc hiệu, ái lực gắn và bổ thể, được tráng lên thành ống nghiệm.

KT đơn dòng thứ 5, được đánh dấu ¹²⁵I phát hiện được các quang tuyến khác nhau từ đó nhận ra nó bởi các KT liên kết với thành ống, được dùng như một tracer.

Các KT này được chỉ thị dựa vào vùng quang tuyến không nhận ra bởi phần lớn các tự KT kháng Tg xuất hiện trong nhiều bệnh TG, bằng cách đó tránh được sự cần thiết có hệ thống đối với các test có đỉnh.

Sau khi ủ chuẩn và mẫu với sự có mặt của KT liên kết ở mức dư thừa của thành ống cũng như của KT đánh dấu, sự loại bỏ phần không liên kết bằng rửa, đo hoạt độ phần liên kết với ống nghiệm cho phép tính được nồng độ Tg.

CHUẨN BỊ 

Người thực hiện

Bác sỹ chuyên ngành Y học hạt nhân

Kỹ thuật viên xét nghiệm RIA

Kỹ sư, kỹ thuật viên vận hành thiết bị đo mẫu 

Cán bộ hóa dược phóng xạ

Phương tiện, hoá chất

Phương tiện

Máy đo Gamma Counter đo ¹²⁵I và xử trí mẫu tự động theo chương trình của hãng.

Máy lắc ngang ( 200-350 vòng/phút ,thường dùng 300 vòng/phút ), -  Máy máy trộn. 

Một giá cắm bộ micropipet có số hút 100 μl , 300 μl , 400 μl, 1.000 μl và các hộp đựng đầu plastic các loại.

Giá cắm ống nghiệm .

Hoá chất:

Thành phần kit gồm:

Mỗi kit chứa đủ hoá chất cho 100 ống. Ngày hết hạn sử dụng được ghi ở nhãn bên ngoài.

Hoá chất	Số lượng	Bảo quản
Ống tráng KT (R1): chuẩn bị sẵn, KT đơn dòng tráng đáy ống.	2 túi 50 ống	2-80C cho đến hết hạn. Sau khi mở gói các ống nghiệm không sử dụng phải để trong túi có chống ẩm (desscicant)
Anti-Tg125I (R2): có s ẵn. KT anti-Tg đơn dòng gắn 125I được hoà loãng trong phosphat/ immunoglobuline không đặc hiệu/ đệm casein, pH7,4 chứa 0,1% NaN3, màu đỏ. ống chứa tối đa 13 μCi~481kBq 125I anti-Tg với hoạt độ riêng 12 Ci/g i.e ~200.000cpm cho 400 μl (444 kBq/μg)	1 ống 42 ml	2-80C cho đến hết hạn.
Dung dịch rửa (R3): dung dịch. Đệm imidazole pH 7,4 chứa 0,1% NaN3 và tween 20. Dung dịch này phải được pha loãng 1/40 với nước cất.	1 lọ 25 ml	2-80C cho đến hết hạn.
Dung dịch đệm (R4): có sẵn. đệm phosphat pH 7,4 chứa 0,1% NaN3, màu vàng cam. Sự pha loãng ht phải được tiến hành bằng dd đệm	lọ 35 ml	2-80C cho đến hết hạn.
Chuẩn (S1- S7): sẵn có. Tg pha loãng trong đệm phosphat pH 7,4 chứa 0,1% NaN3, màu vàng cam. 0.2-1.5-5-15-50-200-500 ng/ml (*).	7 lọ 1 ml	2-80C cho đến hết hạn.
HTKT (C1 – C2): đông khô (**). Huyết thanh người chứa 0,1% NaN3. Tái tạo mỗi ống với 1 ml nước cất.	2 lọ 1 ml	2-80C cho đến hết hạn. Sau tái tạo bảo quản ở +4 0C, có thể sử dụng trong 5 ngày. Các phần không sử dụng có thể làm đông và bảo quản ở – 20 0C. Chỉ làm đông 1 lần. Hoá chất bền vững dưới điều kiện này trong 2 tháng.

(*)Các giá trị ở trên là các giá trị đích: chúng có ở trên nhãn. Các chuẩn được đo dựa vào CRM 407 (vật liệu tham chiếu Tg người).

(**)Giá trị thực trong dải được chấp nhận được in trên nhãn ống.

Tất cả hoá chất phải đưa về nhiệt độ phòng (18-25 ⁰C) ít nhất 30 phút trước khi sử dụng.

CHỈ ĐỊNH

Tất cả người bệnh có bệnh liên quan đến tuyến giáp.Đặc biệt trong chẩn đoán,theo dõi tiến triển của bệnh sau điều trị ung thư tuyến giáp thể biệt hoá bằng ¹³¹I.

CHỐNG CHỈ ĐỊNH:

Không

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Lấy bệnh phẩm

Người bệnh cần nhịn ăn sáng,được lấy1-2 ml máu TM không chống đông.

Tiến hành kỹ thuật

Chuẩn bị huyết thanh người bệnh: Sau khi lấy mẫu máu, huyết thanh được tách bằng phương pháp thông thường. Tiến hành định lượng ngay hoặc bảo quản đến 24 giờ ở 2-8^oC. Thời gian bảo quản lâu hơn nên để ở -20 ^oC, thích hợp hơn là chia đều, làm đông lặp đi lặp lại và tránh làm tan đông. Sau khi làm tan đông, mẫu huyết thanh phải được trộn cẩn thận.

Cảnh báo và đề phòng: Các vật liệu thô có nguồn gốc từ người chứa trong hoá chất của kit này đã được kiểm định với các kit được cấp phép và đã xác định âm tính với KT kháng HIV1, HIV2, HCV và kháng nguyên HbsAg. Tuy nhiên cũng không thể đảm bảo hoàn toàn là những sản phẩm như vậy sẽ không truyền viêm gan, virus HIV hoặc bất kỳ virusẵnào khác, tất cả các vật liệu thô có nguồn gốc người có trong mẫu được định lượng phải được xử trí như tác nhân có tiềm năng nhiễm trùng.

Đi găng dùng một lần khi giữ hoá chất kit hoặc mẫu và rửa tay kỹ sau đó.

Tránh gây đổ vỡ.

Khử ô nhiễm và loại bỏ các mẫu và tất cả các chất có khả năng ô nhiễm nếu chúng chứa tác nhân ô nhiễm. Phương pháp gợi ý là hấp tối thiểu 1h ở 121,5⁰C.

Sodium azide có thể phản ứng với thành ống bằng chì hoặc đồng tạo thành azide kim loại gây nổ mạnh. Trong quá trình loại bỏ chất thải, xả nước kỹ để tránh tạo thành những chất này.

Quy trình định lượng:

Quy trình đòi hỏi những nhóm ống nghiệm sau đây:

Nhóm T để đo tổng hoạt độ.

Nhóm chuẩn để xây dựng đường cong chuẩn.

Nhóm KT để kiểm tra.

Nhóm S_x đối với mẫu cần định lượng.

Nên tiến hành định lượng mẫu kép đối với chuẩn, KT và mẫu.

Việc chuẩn bị đường cong chuẩn và định lượng mẫu phải được tiến hành đồng thời.

Quy trình chuẩn

Ống	Chuẩn S1-7 HTKT C1-2 Mẫu μl	Dd đệm μl	Lắc ủ 3h ở 18-220C. Rửa 2 lần	Tracer 125I μl	Ủ 16-20h ở 18-22 0C, không lắc. Rửa 2 lần	Đo
T	-	-		400
Chuẩn	100	300		400
HTKT Mẫu	100	300		400

Quan sát thứ tự nhỏ hoá chất:

Nhỏ 100 μl chuẩn, HTKT hoặc mẫu vào những nhóm ống nghịêm tương ứng.

Thêm 300 μl dung dịch đệm vào từng ống, trừ ống T.

Đậy ống nghiệm bằng tấm parafin dẻo.

Lắc, ủ 3h ở nhiệt độ phòng (18-22 ⁰C).

Rửa ống nghiệm như sau:

Úp khô ống nghiệm, càng khô càng tốt.

Thêm 2 ml dd rửa vào mỗi ống.

Úp khô.

Nhắc lại quy trình trên một lần nữa.

Để ống nghiệm đứng thẳng 2 phút hoặc úp khô, càng khô càng tốt. Không để có dịch tồn dư trong ống sau rửa.

Nhỏ 400 μl tracer ¹²⁵I vào trong mỗi ống nghiệm.

đậy ống nghiệm bằng tấm parafin dẻo.

ủ qua đêm 16-20 giờ ở nhiệt độ phòng, không lắc.

Rửa ống nghiệm như sau:

Úp khô ống nghiệm, càng khô càng tốt.

Thêm 2 ml dd rửa vào mỗi ống. Úp khô.

Nhắc lại quy trình trên một lần nữa.

Để ống nghiệm đứng thẳng 2 phút hoặc úp khô, càng khô càng tốt. Không để có dịch tồn dư trong ống sau rửa.

Để đạt được kết quả tin cậy và có thể sao lại được, các bước rửa khác nhau phải được tiến hành chính xác. Việc thêm dd rửa phải được tiến hành với tốc độ có hiệu quả để tạo sự xáo trộn trong ống nghiệm.

Đo HTPX phần còn lại gắn với ống bằng máy đo gamma trong 1 phút.

Quy trình nhanh

Ống	Chuẩn S1-7 HTKT C1-2 Mẫu μl	Tracer 125I μl	Lắc Ủ 16-20giờ ở 18-22 0C, không lắc. Rửa 2 lần	Đo
T	-	400
Chuẩn	100	400
HTKT Mẫu	100	400

Quan sát thứ tự nhỏ hoá chất:

Nhỏ 100 μl chuẩn, HTKT hoặc mẫu vào những nhóm ống nghịêm tương ứng.

Nhỏ 400 μl tracer 125I vào trong mỗi ống nghiệm.

Lắc trên máy lắc tròn.

Đậy ống nghiệm bằng tấm parafin dẻo.

Ủ qua đêm 16-20+ ở nhiệt độ phòng, không lắc.

Rửa ống nghiệm như sau:

Úp khô ống nghiệm, càng khô càng tốt.

Thêm 2 ml dd rửa vào mỗi ống. Úp khô.

Nhắc lại quy trình trên một lần nữa.

Để ống nghiệm đứng thẳng 2 phút hoặc úp khô, càng khô càng tốt. Không để có dịch tồn dư trong ống sau rửa.

Để đạt được kết quả tin cậy và có thể sao lại được, các bước rửa khác nhau phải được tiến hành chính xác. Việc thêm dd rửa phải được tiến hành với tốc độ có hiệu quả để tạo sự xáo trộn trong ống nghiệm.

Đo HTPX phần còn lại gắn với ống bằng máy đo gamma trong 1 phút.

NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

Chuẩn bị đường cong chuẩn

Tính xung trung bình cho mỗi cặp. Nếu cần tính phần trăm liên kết B/T (%). Vẽ đường cong trên giấy nửa log, bằng cách đánh dấu cpm hoặc B/T (%) trên trục y và nồng độ của chuẩn trên trục x.

Nồng độ Tg được xác định bằng phép nội suy từ cpm hoặc B/T (%).

Đường cong điển hình (chỉ là VD): những dữ liệu này không thể thay thế dưới bất kỳ trường hợp nào cho các kết quả thu được từ labo.

	Concentration (ng/ml)	cpm
Total activity		187089
S1	0.2	112
S2	1.5	529
S3	5	1207
S4	15	3130
S5	50	9635
S6	200	37848
S7	500	84289
C1	10.7	2708
C2	110	23854

CÁC GIÁ TRỊ MONG ĐỢI

Mỗi labo nên thiết lập một dải giá trị bình thường của riêng mình. Các giá trị cho dưới đây chỉ là tham khảo.

Các giá trị thu được ở các đối tượng được cho là kho  của cả hai giới nằm trong dải nồng độ sau (n = 149).

Dải nồng độ	Số Người bệnh	%
0 – 5 ng/ml	11	7.4
5 – 10 ng/ml	37	25.0
10 – 20 ng/ml	61	41.0
20 – 30 ng/ml	20	13.0
30 – 50 ng/ml	15	10.0
> 50 ng/ml	5	3.4

NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

Ý nghĩa lâm sàng của định lượng Tg

Trong ung thư học: để kiểm soát giai đoạn ung thư  tuyến giáp biệt hoá. Sau cắt giáp toàn phần, Tg là một marker sớm, đáng tin cậy để phát hiện di căn.

Trong các bệnh tuyến giáp lành tính: Định lượng Tg có thể được sử dụng để theo dõi giai đoạn của bệnh Basedow và cho chỉ dẫn khi nào thì ngừng điều trị. Nồng độ Tg còn tăng trong một vài dạng viêm giáp khác nhau, đặc biệt là trong viêm giáp mạn tính Hashimoto.

Trong chẩn đoán phân biệt các nang giáp và cận giáp bằng định lượng đồng thời Tg và hormone cận giáp.

Để chẩn đoán phân biệt vô sinh tuyến giáp và tuyến giáp lạc chỗ: trong nhược giáp sơ sinh sự xuất hiện Tg gợi ý chuẩn đoán tuyến giáp lạc chỗ, nếu Tg âm tính là vô sinh tuyến giáp.

Để chuẩn đoán phân biệt các loại độc giáp trạng. Trong nhiễm độc giáp liên quan đến amiodaron, nồng độ Tg cao, nếu nhiễm độc giáp giả thì Tg không có.

Cho đến nay, người ta thấy tự KT kháng Tg xuất hiện trong huyết thanh có ảnh hưởng đến kết quả của định lượng Tg. THYROGLOBULINE IRMA kit sử dụng KT đơn dòng để xác định sự hiện diện của Tg không nhận biết được cáctự KT của Người bệnh, bằng cách đó cho phép định lượng Tg có thể tin cậy được thậm chí với sự có mặt của các tự KT.

Thường xuyên chuẩn máy trước khi đo mẫu.

Chấp hành đúng các quy tắc vệ sinh an toàn phóng xạ

Sản phẩm phóng xạ này chỉ có thể được nhận, mua, bảo quản hoặc sử dụng bởi những người được phép sử dụng và bởi các labo đã được kiểm soát bởi các điều kiện cấp phép. Bắt buộc tuân thủ các qui tắc cơ bản về quản lý sản phẩm phóng xạ để đảm bảo an toàn. 

Không ăn, uống, hút thuốc, dùng mỹ phẩm trong vùng kiểm soát.

Không hút dung dịch phóng xạ bằng miệng.

Tránh tiếp xúc trực tiếp với tất cả sinh phẩm phóng xạ bằng cách sử dụng áo choàng labo và găng tay bảo vệ.

Thiết bị và đồ thuỷ tinh labo bị ô nhiễm phải được loại bỏ ngay sau ô nhiễm đê tránh nhiễm chéo bởi các đồng vị khác.

Tất cả rác thải phóng xạ loại bỏ phải tiến hành theo pháp lệnh hiện hành.