ĐỊNH LƯỢNG TGF-β2 (Transforming Growth Factor β2)

ĐỊNH LƯỢNG TGF-β2 (Transforming Growth Factor β2)

 

TGF-β2 là một polypeptid chứa 412 axit amin. Yếu tố chuyển đổi tăng trưởng β (TGF-β) được sản xuất bởi nhiều tế bào và các loại mô, ví dụ tiểu cầu, mô xương, nhau thai và thận. Tuy nhiên, TGF-β2 không được sản xuất bởi các tiểu cầu, trái với TGF-β1. Nó điều chỉnh sự phát triển phôi thai, hình thành xương, phát triển vú, chữa lành vết thương, tạo máu. TGF-β2 đã được chứng minh là một yếu tố ức chế sự tăng trưởng mạnh trong điều hòa tế bào thần kinh tiểu não và tăng sinh nguyên bào thần kinh tiểu não sau sinh. TGF-β2 còn được phát hiện trong dịch nước mắt.

NGUYÊN LÝ

Dùng kỹ thuật ELIS để định lượng TGF-β2 trong huyết tương, huyết thanh và phần nổi nuôi cấy tế bào.

Dựa vào tính đặc hiệu của kháng nguyên - kháng thể theo phương pháp sandwich: trước khi làm xét nghiệm, standard và mẫu người bệnh được hòa loãng với dung dịch đệm, axit hóa với HCl, rồi trung hòa với NaOH. Sau đó, các mẫu được ủ trong các giếng đã được phủ với kháng thể đa dòng TGF-β2. Sau khi rửa sạch các thành phần không kết hợp, Enzym liên hợp (kháng thể IgG chuột liên hợp biotin), phức hợp enzym (Streptavidin Peroxidase) lần lượt được thêm vào rồi được ủ. Một phức hợp sandwich enzym miễn dịch được hình thành. Sau khi rửa đi các thành phần không kết hợp, thêm cơ chất rồi dung dịch ngừng phản ứng vào. Đậm độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ TGF-β2 trong mẫu, được đo ở bước sóng 450 nm.

CHUẨN BỊ

Người thực hiện

Bác sĩ, cử nhân, kỹ thuật viên được đào tạo với máy Evolis Twin Plus

Phương tiện, hóa chất

Máy phân tích ELIS (có thể Evolis Twin Plus)

Thuốc thử được cung cấp của hãng DGR, Đức (EI -2396)

Đĩa phản ứng (96 giếng)

Enzym liên hợp

Chuẩn: 1 lọ

Cơ chất

Dung dịch đệm

Dung dịch rửa

HCL 1 N

Dung dịch ngừng phản ứng

NaOH 1 N

Phức hợp enzym

Thuốc thử và dụng cụ cần nhưng không được cung cấp

Pipet chính xác

Các tube

Đầu côn pipet dùng một lần

Nước cất

Giấy chỉ thị màu

Control 2 mức thấp và cao

Người bệnh

Người bệnh không cần nhịn đói và không có yêu cầu gì đặc biệt khác

Phiếu xét nghiệm

Phiếu xét nghiệm theo mẫu bệnh viện và Bộ Y tế quy định, có ghi đầy đủ thông tin người bệnh.

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Lấy bệnh phẩm

Thu thập mẫu

Sử dụng huyết thanh, huyết tương chống đông bằng EDT, citrate hoặc chất nổi trong nuôi cấy tế bào

Huyết thanh: để co cục máu, ly tâm ở nhiệt độ phòng

Huyết tương: ly tâm ngay sau khi thu thập

Mẫu được tách tube và ổn định ở 2 – 8^o C trong 24 giờ, lâu hơn thì làm đông ở -20^o C.

Mẫu sau khi rã đông nên votex trước khi làm.

Xử lý mẫu

Huyết thanh và huyết tương

Hòa loãng mẫu với dung dịch đệm theo tỉ lệ 1:50 (ví dụ: 10 μl mẫu + 490 μl dung dịch đệm).

Mẫu tế bào nuôi cấy

Ly tâm mẫu, hòa loãng mẫu với dung dịch đệm theo tỉ lệ 1:10 (ví dụ: 10 μl mẫu + 90 μl dung dịch đệm).

Axit hóa và trung hòa mẫu và chuẩn:

Thêm 200 μl calibrator, control hoặc mẫu đã hòa loãng vào tube phản ứng. + Thêm 20 μl HCl 1N vào

Đậy nắp, trộn đều và để trong 15 phút

Thêm 20 μl NaOH 1N để trung hòa, trộn đều.

Sau khi trung hòa, các mẫu nên có giá trị pH từ 7 và 8. Vì vậy hãy kiểm tra giá trị pH với giấy chỉ thị màu.

Tiến hành kỹ thuật

Chuẩn bị thuốc thử

Đưa tất cả thuốc thử về nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.

Dung dịch rửa:

Hòa 30 ml dung dịch rửa với 1170 ml nước cất để được dung dịch 600 ml.

Sau khi pha, ổn định 2 tuần ở nhiệt độ phòng.

Chuẩn:

Lọ chuẩn gốc có nồng độ 1000 pg/mL

Pha loãng nhiều lần với dung dịch đệm để được chẩn B, C, D, E, F với các nồng độ lần lượt tương ứng là 500 pg/mL; 250 pg/mL; 125 pg/mL; 62,5 pg/mL; 31,25 pg/mL và G là dung dịch đệm (0 pg/mL)

Ổn định 1 tuần khi bảo quản ở 2 – 8^o C, lâu hơn khi làm đông ở - 20^o C

Tiến hành

Tiến hành theo quy trình cài đặt trên máy tự động EVOLIS TWIN PLUS. - Tổng thời gian làm xét nghiệm này khoảng 355 phút (gần 6 giờ) - Vẽ đường cong chuẩn trước, control đạt thì tiến hành đo mẫu.

Các bước tiến hành như sau:

Hút 100 μl mỗi calibrator, control hoặc mẫu người bệnh vào các giếng

Phủ giấy kín và ủ 3 giờ ở nhiệt độ phòng

Lấy giấy phủ ra, loại bỏ các chất ra khỏi giếng, rửa các giếng 3 lần với 300 μl dung dịch rửa cho mỗi giếng trong một lần rửa

Hút 100 μl enzym liên hợp vào mỗi giếng

Ủ 120 phút ở nhiệt độ phòng

Loại bỏ các chất ra khỏi giếng, rửa các giếng 3 lần với 300 μl dung dịch rửa cho mỗi giếng trong một lần rửa

Hút 100 μl phức hợp enzym vào mỗi giếng

Ủ 20 phút ở nhiệt độ phòng

Loại bỏ các chất ra khỏi giếng, rửa các giếng 3 lần với 300 μl dung dịch rửa cho mỗi giếng trong một lần rửa

Hút 100 μl cơ chất vào mỗi giếng

Ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng

Hút 50 μl dung dịch ngừng phản ứng vào mỗi giếng, trộn đều

Tiến hành đo với bước sóng 450 nm trong khoảng 10 phút

NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

Mỗi phòng thí nghiệm nên xác định các giá trị riêng bình thường và bất thường của mình.

Ý nghĩa lâm sàng: Nồng độ TGF-β2 tăng trong

Thủy tinh thể của người bệnh có bệnh lý võng mạc đái tháo đường tăng sinh.

Người bệnh có khối u ác tính.

Tăng nhiều trong dịch não thất ở bệnh Parkinson.

NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

Có một số sai sót thường gặp:

Lấy sai ống   lấy lại

Tuyệt đối không sử dụng máu vỡ hồng cầu, máu đục, máu vàng

Mẫu máu ở người bệnh có dùng thuốc chống đông thì thời gian co cục máu lâu hơn trước khi ly tâm (hơn 30 phút)

Những sai sót do máy thì hỏi kỹ sư để XỬ TRÍ

Lưu ý Calibrator và QC bảo quản thật tốt để có đường cong chuẩn đạt yêu cầu.