Trị liệu miễn dịch ung thư bằng cách chuyển gen được đích bởi các tế bào tua

Trị liệu miễn dịch ung thư bằng cách chuyển gen được đích bởi các tế bào tua (dendritic cell)

TẾ BÀO ĐÍCH LÀ NHỮNG LÍNH GÁC CỬA CỦA CƠ THỂ

Các tế bào tua (dendritic cell –DC) đã trở thành “niềm hy vọng sáng chói” đối với các nhà trị liệu miễn dịch. Cho tới nay,  DC là các TB trình diện kháng nguyên mạnh nhất  (antigen-presenting cells – APC) đã được xác định, duy nhất có khả năng mồi các tế bào T tự nhiên và vì thế mà khởi đầu cho các đáp ứng miễn dịch. Thực chất là, chúng tạo được mối liên lạc quan trọng nhất giữa hệ thống miễn dịch bẩm sinh với miễn dịch thu được và như vậy đã thể hiện được sự vận hành ở cấp cơ bản của điều hòa miễn dịch trong nhiều quá trình miễn dịch.

DC nảy sinh phổ biến từ CD34⁺ tủy xương – bắt nguồn từ những tế bào tiền thân, có thể biệt hóa thành các tiểu quần thể khác nhau, về  bản chất nó có thể có nguồn gốc từ tủy xương hoặc bạch huyết bào. DC tiền thân từ máu tới các mô ngoại biên, tại đó chúng phát triển thành các DC chưa trưởng thành hoặc DC tĩnh. Sự thật là các DC chưa trưởng thành cũng không phải là quá tĩnh hay bất biến. Chúng luôn luôn được chọn làm mẫu với môi trường xung quanh và giám sát “sức khỏe’ của các mô ngoại biên thông qua đa tiếp xúc với các TB bên cạnh.  Bởi vậy, nó cần thiết cho việc duy trì sự tiếp xúc liên tục với nhiều TB, và thông qua đặc trưng hình thái học mà chúng có tên là TB tua (dendritic cell).

Khi mô bị thương tổn quá mức hay có dấu hiệu bị vi khuẩn hay virus xâm nhập có thể làm tăng nhanh sự tăng trưởng của TB (biệt hóa đến giai đoạn cuối cùng), các DC di trú khỏi các hạch bạch huyết, tại đây chúng báo động cho hệ thống miễn dịch mọi tình huống có thể bi đe dọa. Bởi vậy, DC có chức năng bảo vệ rất quan trọng và nó phục vụ như là hệ thống an ninh của cơ thể. Thông thường, hệ thống an ninh này rất hiệu quả trong việc hoạt hóa một cách thích hợp các TB hiệu ứng nhằm chống lại sự thâm nhiễm của virus và vi khuẩn. Các DC liên lạc và điều hòa sự biệt hóa nhiều TB hiệu ứng như tế bào T-helper (Th), các lympho T độc TB (cytotoxic T lymphocyte - CTL), các tế bào B, các TB giết tự nhiên (natural killer cell - NK) và các tế bào T giết tự nhiên (natural killer T cell – NKT) thông qua hệ thống phối hợp tinh vi chính xác các mẫu biểu hiện cytokin, chemokin (và các receptor của chúng) cũng như các phân tử đồng kích thích (costimulatory) và kết dính và sau chót là các phân tử hiệu ứng miễn dịch (các kháng thể, granzym, cytokin, FasL). Các DC và các tế bào khác được hoạt hóa bởi chúng để có thể có biện pháp thích hợp xử lý bất kỳ mối đe dọa nào từ bên ngoài đối với cơ thể. Rõ ràng là, việc khai thác năng lực của các DC để điều hòa miễn dịch là các đề xuất hết sức hấp dẫn trong việc chống lại bất kỳ loại bệnh nào với nền tảng miễn dịch. Vì vậy, chẳng có gì ngạc nhiên về những hiệu ứng “khủng” đã đạt được trong việc khám phá ra các phương pháp để hướng các DC vào việc điều chỉnh có tính trị liệu các chức năng của chúng.

Sự phát sinh  miễn dịch ung thư: thúc đẩy thông qua các thủ đoạn

“Mối nguy cơ” (danger) là một khái niệm quan trọng đối với sinh học DC. Thật vậy, kể từ khi Polly Matzinger gợi ý một mô hình “mối nguy cơ”, đã nhiều năm nay danger đã trở nên “thời trang”  và nhiều mô hình thiết kế đã được sử dụng để điều khiển sự hoạt hóa của các DC. Trong khi tính miễn dịch của tế bào T trước đây được cho là quyết định bởi “ngã” và “bất ngã” (self and nonself), thì mô hình danger lại cho rằng các tín hiệu trong các mô ngoại vi mới là yếu tố quyết định đối với sự hoạt hóa tế bào T: các tín hiệu tiền viêm kết hợp với nhiễm khuẩn sẽ dẫn đến hoạt hóa DC, nâng cao vị thế của DC đối với sự di trú tới hạch lympho và hoạt hóa các tế bào T đặc hiệu. Trái lại, trong trạng thái ổn định (steady- state) thì DC không được hoạt hóa (không chín) và vẫn duy trì ở trạng thái dung nạp ngoại biên (peripheral tolerance). Có nhiều bằng chứng ủng hộ  cho mô hình này và các nhà miễn dịch ung thư đặc biệt khích lệ với mô hình đó.

Nhìn chung, trong các môi trường khối u thì thiếu các tín hiệu nguy hiểm (danger), hệ miễn dịch không nhận thức được khối u là một hiểm họa có thể. Thay vì,  môi trường của các khối u đang phát triển lại giống như ở trạng thái ổn định và DC không được biệt hóa. Ở các giai đoạn muộn hơn của sự phát triển khối u thì sự biệt hóa và hoạt hóa DC thậm chí còn bị kiềm chế. Vì lý do này mà sự dung nạp tế bào T ngoại biên được duy trì.

Vì các kháng nguyên liên kết khối u (tumor-asociated antigen –TAA)  thường là các tự kháng nguyên (self-antigen) nên việc phát sinh tính miễn dịch kháng u thực chất là cảm ứng tự miễn. Tính cố hữu của khái niệm danger là khả năng bẻ gãy các dung nạp ngoại biên đối với các tự kháng nguyên thông qua việc chuyển giao đầy đủ các tín hiệu danger. Nói cách khác, có thể đánh lừa hệ miễn dịch bằng cách coi như các vi sinh vật từ bên ngoài gây nên khối u chứ không phải do cơ thể thì các DC trong khối u sẽ trở nên hoạt hóa và kích thích tính miễn dịch của tế bào T.

Tính logic của khái niệm này ngày nay đã được khẳng định và ngày càng phát triển các nghiên cứu về sự thải trừ khối u ở các mô hình chuột và là hứa hẹn tuyệt vời đối với trị liệu miễn dịch tương lai.

Hướng các DC vào việc  trị liệu miễn dịch ung thư

 Những số liệu về TAA được xác định ngày càng nhiều đã mở rộng cửa cho việc trị liệu miễn dịch ung thư. Các gen liên kết ung thư có thể chia thành các thể loại khác nhau như các gen ung thư đột biến (mutated oncogene) (ras) hay các gen kiềm chế khối u (tumor-suppressor gene) (p53), các gen phát triển ngoài quy luật hoặc các gen phôi (embryonic gene) (carcinoembryonic antigen), các gen yếu tố  tăng trưởng (ErbB2), các gen đặc hiệu mô (tyrosinase), gen ung thư tinh hoàn (cancer-testi gene) (mage) hoặc các gen nguồn gốc từ oncovirus (HPV- 16 E7).

Để phù hợp với ứng cử viên tiêm chủng, các TAA chỉ được phép biểu hiện ở mô khối u hoặc ít nhất thì chỉ biểu hiện quá mức ở đó thôi thì mới có thể mở được cánh cửa diệt trừ khối u qua trung gian tế bào T nhưng lại không hủy hoại các mô bình thường. Lý tưởng là các TAA phải là nguyên phát đối với quá trình gây ung thư, vì vậy chúng là vật thể cố định vĩnh viễn đối với kiểu hình (phenotype) ác tính, và sẽ ngăn chặn sự tăng trưởng quá mức của các biến thể né tránh CTL thông qua sự điều hòa xuống TAA đích. 

Nhiều TNLS đang được tiến hành về hiệu lực của tiêm chủng dựa trên cơ sở DC với các TAA đặc hiệu. Chiến lược thông thường là sản xuất  ex vivo các DC tự thân từ các tiền thân DC bắt nguồn từ máu, sau đó nạp các protein TAA hay các peptid đi từ TAA có mang các epitope CTL và/hoặc Th rồi  đưa trở lại bệnh nhân. Một cách khác là chuyển các gen mã hóa TAA  tới các DC.

Cải biến gen của các DC cho trị liệu miễn dịch có thể đem lại những lợi thế nhất định. Trái lại, nếu sử dụng các protein, một vaccin TAA công nghệ gen sẽ cung cấp một nguồn liên tục lâu dài TAA bởi các DC đã tải nạp. Hơn nữa, sự biểu hiện TAA nội sinh do kết quả của sự chuyển gen đảm bảo cho sự tiếp cận với con đường xử lý của phức hệ h a hợp tổ chức chính (MHC) lớp I, điều đó cần thiết cho sự hoạt hóa tiếp theo của các CTL đặc hiệu. Với vô số các kỹ thuật tái tổ hợp phân tử và sự gia tăng nhanh chóng những kiến thức về sinh học DC nên hiện giờ có khả năng cải biến các vaccin công nghệ gen để đích chúng một cách đặc hiệu. Đây không chỉ là một chiến lược tiêm phòng “trí tuệ” mà nó còn giảm được chi phí và sự hao tổn thời gian mày m  với các cách tiếp cận nặng nhọc khác trong việc sản xuất và tải các DC tự thân ex vivo. 

Trong chương này chúng ta sẽ xem xét một cách khái quát các kiến thức hiện đại liên quan đến kiểu hình (phenotype) và trạng thái chức năng của các DC trong môi trường khối u và những phương thức trong đó DC thường trực trong môi trường khối u để có thể kích thích và hướng cho trị liệu gen miễn dịch tăng thêm cơ hội thành công trong lâm sàng.

Tuy nhiên, những cách tiếp cận ex vivo đang áp dụng hiện nay lại tương phản với cách tiếp cận in vivo.

NGUỒN GỐC VÀ CÁC TIỂU QUẦN THỂ  DC 

Các tiểu quần thể DC khác nhau đã được phân biệt rõ ràng, mỗi tiểu quần thể có thể có chức năng điều hòa miễn dịch một cách chuyên biệt. Rõ ràng là, nếu các trị liệu được đích bởi các DC là rất hiệu lực. Điều quan trọng là phải biết nhắm vào tiểu quần thể nào. Dưới đây là tóm lược về các tiền thân và các tiểu quần thể DC chính của người đã được xác định cho tới nay. Điều không kém phần quan trọng cần được nhận thức là trong nhiều trường hợp vẫn chưa sáng tỏ một cách tuyệt đối rằng liệu đây có phải là các tiểu quần thể thực sự khác biệt hay chỉ là các DC đơn thuần từ cùng một tiểu quần thể nhưng lại có các kiểu hình khác nhau do tác động bởi các yếu tố vi môi trường. Các nghiên cứu như thế này vẫn đang còn tiếp tục, tuy nhiên rất phức tạp vì số lượng DC in vivo cực kỳ thấp.

Các tế bào tiền thân của DC

Dưới đây là tổng quan ngắn gọn về các tế bào tiền thân của các DC khác nhau (được xác định in vtro hay in vivo) giúp cho chúng ta hiểu rõ hơn nữa về ý nghĩa cũng như ứng dụng của nó trong việc thiết lập các quy trình trị liệu.

Bạch cầu đơn nhân (monocyte)

 Các bạch cầu đơn nhân xuất thân từ máu CD14⁺  thường hay được sử dụng nhất trong việc tạo ra các DC in vitro, cả trong nghiên cứu cũng như trên lâm sàng. Một lượng tương đối lớn bạch cầu đơn nhân có thể  phân lập được từ máu ngoại biên (bằng cách kết dính trên chất dẻo) và biệt hóa thành các DC chưa chín CD1a⁺ CD14^--  qua liệu trình nuôi cấy 5-7 ngày với sự có mặt của yếu tố kích thích quần thể đại thực bào - bạch cầu hạt (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor: GM-CSF) và interleukin 4 (IL- 4). Các tế bào DC như các tế bào Langerhans (LC- là các DC chuyên biệt của biểu bì) đặc trưng là biểu hiện lectin langerin, cũng được tạo ra từ bạch cầu đơn nhân bằng cách nuôi cấy DC cùng với yếu tố tăng trưởng biến nạp β (transforming growth factor β (TGF- β) hoặc IL-15. Những DC bắt nguồn từ bạch cầu đơn nhân này (monocyte- derived DC: MoDC) có thể còn phát triển xa hơn nữa nếu có sự hiện diện của các tác nhân cảm ứng đột biến thông thường như yếu tố hoại tử khối u- α (tumor necrosis factor α (TNF- α), lipopolysaccharid (LPS) hoặc môi trường thích hợp cho bạch cầu đơn nhân. Các MoDC trưởng thành biểu hiện CD83 – một thành viên của họ immunoglobulin và là dấu xác nhận sự trưởng thành của DC, cũng có thể được sử dụng để hoạt hóa CTL đặc hiệu khối u. Cả DC và đại thực bào đều có thể được phát triển từ các bạch cầu đơn nhân đại diện cho một quần thể tiền thân dị loại. Các bạch cầu đơn nhân CD2⁺ đã được xác nhận trước đây là một tiểu quần thể của bạch cầu đơn nhân mà ở đó các MoDC được biệt hóa một cách ưu tiên.

Bạch cầu đơn nhân cũng thấy biệt hóa thành các DC trưởng thành thông qua quá trình di trú ngược qua lớp tế bào nội mô. Quan sát thú vị này cho thấy, bạch cầu đơn nhân hay đại thực bào ở mô ngoại biên khi có mặt các tín hiệu danger thích hợp (đại thực bào cũng có liên quan trong quá trình này) thì có thể di trú vào mạch bạch huyết (di trú ngược) và ngay lập tức thành DC kích thích tế bào T. Vì thế, việc đích các đại thực bào/bạch cầu đơn nhân CD14⁺ in vivo là một lựa chọn thú vị cho trị liệu miễn dịch ung thư với điều kiện là sự di trú tiếp theo cũng đi vào mạch bạch huyết và sự chín của các DC có thể được thực hiện bằng một cách nào đó.

Các tế bào gốc CD34⁺

Các tế bào CD1a⁺  DC có thể được biệt hóa từ các TB gốc CD34⁺  tăng sinh bắt nguồn từ tủy xương tuần hoàn trong máu ngoại biên bằng cách nuôi cấy in vitro 2-3 tuần với sự có mặt của GM-CSF, IL-4 và TNF- α (ở đây gọi tắt là CD34-DC).  Nếu thêm TGF- α vào những nuôi cấy này thì sẽ tạo được langerin⁺  LC, và kết quả là DC có thể tiếp tục phát triển và được sử dụng để hoạt hóa tế bào T. Thực vậy, đã có bằng chứng cho thấy CD34-DC có hiệu lực hơn so với MoDC trong việc “mồi”.

Tuy vậy, mặc dù chúng có tiềm năng tăng sinh nhanh, nhưng thực tế lại thấy các tế bào CD34⁺ thường có nồng độ cực kỳ thấp ở máu ngoại biên (thường < 0,1%) nên nó làm cản trở cho việc sử dụng trong lâm sàng vì vậy phải tăng cường huy động chúng tới máu thông qua việc xử lý toàn hệ thống trước với các yếu tố tăng trưởng tạo máu như yếu tố kích thích quần thể bạch cầu hạt (granulocyte-colony-stimulating factor: G-CSF), GMCSF hoặc tyrosin kinase 3 ligand (FLT3L) giống như các Fm. Cách khác là nhân rộng in vitro các tế bào CD34⁺ đã được phân lập bằng hỗn hợp cytokin bao gồm FLT3L, yếu tố TB gốc, IL-3, thrombopoietin và IL-6  để chúng biệt hóa thành các DC chức năng.

Các DC máu ngoại biên có nguồn gốc từ CD11⁺  

Một tiểu quần thể các tế bào CD11c^hi Cd14^lo CD33⁺ đã được xác định là tiền thân trực tiếp của các DC dòng tủy. Thông qua nuôi cấy in vitro ngắn hạn (1-2 ngày) có hoặc không có cytokin biệt hóa DC, những tiền thân DC máu ngoại biên này (peripheral blood DC precursor – PBDC) có thể thành các DC biệt hóa hoàn toàn có biểu hiện các phân tử đồng kích thích HLA – DR mức cao và các marker đặc hiệu DC là CMRF-56 và CMRF-14. Các PBDC được cho là bắt nguồn từ các tiền thân CD34⁺ sớm hơn và thường chỉ chiếm chưa đầy 1% tổng số quần thể PBDC.

Các tiểu quần thể khác trong quần thể PBDC dòng tủy cho tới nay cũng đã được xác định với sự biểu hiện biệt hóa của các marker CD1c, BDCA-3 và M-DC8) 6-sulfo LacNac - một cải biến carbohydrat của P- selectin glucoprotein ligand). Vẫn chưa rõ là các tương đồng DC mô đặc biệt nào có thể được bắt nguồn từ các tiểu quần thể CD1c⁺  và BDCA-3, nhưng có thể là các LC được biệt hóa từ tiểu quần thể CD1c⁺ PBDC.

Các tế bào M-DC8⁺CD16 ⁺ CD14^lo PBDC đã được xác định là quần thể DC ưa di trú trong một mô hình tương tự như da và được cho là đại diện cho tiểu quần thể DC gây tiền viêm, chúng có thể được tuyển mộ nhanh chóng tới các vị trí thâm nhiễm qua biểu hiện Feγ RIII (CD16) và các receptor bổ thể (C5aR và C3aR). Các CD11c⁺ PBDC còn hoạt hóa in vitro cao hơn các chất kích thích tế bào T cao cấp có khả năng mồi các tế bào T khác loại và các CTL đặc hiệu. Điều này chỉ rõ rằng có thể sử dụng chúng để tạo ra các DC tự thân với mục đích tiêm phòng trong điều trị ung thư. Tuy nhiên, vấn đề này có thể chưa được khả thi vì có sự giảm tần suất và suy yếu kiểu hình cũng như trạng thái hoạt hóa chức năng của chúng trong các bệnh nhân ung thư. Các yếu tố kiềm chế bắt nguồn từ khối u (yếu tố tăng trưởng nội mô mạch [VEGF] ) có liên quan đến hiện tượng kiềm chế DC liên kết ung thư.

Các PBDC tương bào CD11c^-

Một tiểu quần thể PBDC mới đã được xác định với đặc trưng là không biểu hiện CD11c nhưng lại biểu hiện receptor IL-3  ở  mức cao.  Dựa trên cơ sở hình thái học thì những tế bào này được xác định là các DC tương bào. Không giống như các bản sao DC11c⁺, các PBDC tương bào thể hiện các đặc tính của lympho bào chẳng hạn như biểu hiện CD4 và mRNA đối với immunoglobulin K dòng mầm và receptor tiền tế bào T. Các PBDC tương bào trực tiếp trở về các hạch bạch huyết thông qua Lselectin, trong đó chức năng chính của chúng tương tự như các DC dòng tủy ở các mô ngoại biên. Bên cạnh các kiểu hình CD123^hi CD11c^- đặc trưng, các PBDC tương bào còn  biểu hiện BDCA-2  (vừa mới được xác định là lectin type C và BDCA-4 [neutropilin]). Trong nuôi cấy với IL-3, các PBDC tương bào biệt hóa cuối cùng thành các PDC có khả năng lái các tế bào T thành đáp ứng typ 2 hoặc CD40L và /hoặc kích thích virus để nâng cao tính miễn dịch của tế bào NK và CTL.

Các dòng tế bào tiền thân bệnh bạch cầu và tiền thân DC

Một loại DC đặc biệt xứng đáng được đề cập ở đây là TB bệnh bạch cầu dòng tủy bắt nguồn từ bệnh bạch cầu dòng tủy cấp hay mạn tính. Những TB bệnh bạch cầu này có thể được coi như là các TB tiền thân dòng tủy đa năng (pluripotent). Trên nuôi cấy với GM-CSF và IL-4 có hoặc không có TNF-α thì chúng có các đặc trưng về chức năng và kiểu hình của DC. Bởi vì các DC bắt nguồn từ các TB gây bệnh bạch cầu dòng tủy cấp hay mạn tính vẫn biểu hiện TAA ( đáng chú ý nhất là các protein ung thư  bcr-abc) nên chúng thích hợp cho việc chế tạo vaccin kháng u tự thân.

Sau chót là một vài dòng TB bắt nguồn từ các loại u ác tính này cũng có khả năng biệt hóa thành các DC chưa chín với phương thức phụ thuộc cytokin. Những DC chưa chín này có thể tải các protein hay peptid miễn dịch hoặc bị thâm nhiễm bởi các vec tơ adenovirus mã hóa kháng nguyên và khi chín thì có thể hoạt hóa được các tế bào T với phương thức đặc hiệu kháng nguyên.

Những dòng tế bào này đã tạo ra một công cụ nghiên cứu hấp dẫn được cung ứng dễ dàng và hằng định với tư cách là các tiền thân DC, đồng thời cũng chứng minh được tính hữu ích trong cách tiếp cận vaccin bán dị loại. Hơn nữa, các thể chuyển nhiễm (transfectant) ổn định của các dòng tế bào DC lại có thể tạo ra các công cụ “làm sẵn” (ready-made) cho các phương pháp trị liệu miễn dịch.

Các tiểu quần thể DC

Các tiểu quần thể và vai trò  chính của chúng là sản sinh và điều hòa các đáp ứng tế bào T đặc hiệu cũng như  khả năng đích đặc hiệu cho các thao tác trị liệu. Vẫn còn nhiều tranh cãi như liệu mỗi tiểu quần thể có một chức năng điều hòa chuyên biệt hay các tiểu quần thể khác nhau đều có cùng chức năng điều hòa tương tự và phụ thuộc rất nhiều vào trạng thái chín (trưởng thành) của DC. Rất có thể là hâụ quả miễn dịch cuối cùng liên quan mật thiết với trạng thái chín của mỗi tiểu quần thể, nhưng các định vị giải phẫu khác nhau của chúng lại làm cho chúng có các chức năng chuyên biệt.

Các tế bào Langerhans

Các tế bào Langerhans (LC) là các tế bào của biểu bì và là các DC được mô tả đầu tiên. Chúng vẫn được coi như là các DC nguyên mẫu và là chủ đề nghiên cứu được nhiều người quan tâm.  Các LC thấy ở lớp cơ sở và lớp cơ sở xa hơn (basal and suprabasal layer) của biểu bì và trong trạng thái chưa chín, đặc trưng bởi biểu hiện ở mức cao CD1a và C-type lectin langerin.

Langerin có liên quan đến sự bắt giữ kháng nguyên (KN) và được chỉ rõ là gây cảm ứng cho sự hình thành hạt và là một phần trong các hạt nhỏ Birbeck tế bào chất đặc hiệu LC. Các hạt Birbeck là các tổ chức hình ống được gắn trên màng để cấu thành nên các ngăn nội bào chuyên biệt cho các kênh KN trong những con đường xử lý đặc hiệu.

Các LC chưa chín và các tiền thân của chúng còn có các đặc trưng khác nữa là biểu hiện KN bạch cầu của da và  E-cadherin, cả 2 phân tử kết dính này đều liên quan tới việc dẫn đường tới da và  biểu bì. 

Trong nhiều trường hợp mạng lưới dày đặc và được phân nhánh của mạng lưới LC ở biểu bì đã tạo nên hàng rào đầu tiên kháng lại bất kỳ nguy cơ nào từ bên ngoài. Có bằng chứng cho thấy trên con đường hoạt hóa và di trú tới các hạch bạch huyết (LN), các LC thích gắn và hoạt hóa các tế bào T hơn (chứ không phải là các tế bào B). Hệ quả là chúng có khả năng đáp ứng cho sự khởi đầu miễn dịch trung gian tế bào typ 1 hơn là miễn dịch thể dịch typ 2. Phù hợp với vấn đề này, các tế bào giống như LC được sản sinh từ các bạch cầu đơn nhân thể hiện là các nhân tố hoạt hóa CTL hạng “top”. Vì miễn dịch trung gian tế bào nói chung là rất quan trọng đối với việc trừ diệt khối u nên nó rất có ích cho việc đích đặc hiệu các LC và các tiền thân của chúng cho trị liệu miễn dịch kháng u, vì những TB này biểu hiện đặc hiệu E-cadherin, langerin và CD1a ở mức cao.

Các DC kẽ hoặc DC da

Trái ngược với LC, các tế bào DC da DCs (DDCs) không biểu hiện langerin và chỉ biểu hiện CD1a ở mức thấp đến trung bình. Thay vì, các DDCs lại biểu hiện một quần thể lectin khác bao gồm: receptor manose (MR), DEC-205 và DC-SIGN cũng như yếu tố XIIIa và CD68. Các DCs dòng tủy không ở các mô ngoại biên mà lưu thông khắp cơ thể, giống các DDCs về kiểu hình và cũng được hiểu là các DCs kẽ.  

Không giống như các LC, DDCs lại sản xuất ra IL-10 và có khả năng chuyển hướng tới việc sản sinh ra các đáp ứng kháng thể typ 2. Tuy nhiên, khả năng trèo lái tế bào T của các DCs/DDCs kẽ  là không cố định, nhưng lại khá quyết định trong việc cân bằng các yếu tố trong vi môi trường.

Sự hiện diện của các LPS, interferon-γ (IFN-γ), Il-15 hay IL-4 có thể làm tăng xu hướng giải phóng IL-12 của các DDCs với sự kích thích của CD40L, vì vậy mà kích thích sự hoạt hóa của Th1 và CTL; TNF-α, IL-10 và PGE2 lại kích thích sản sinh IL-10; kết quả là kiềm chế miễn dịch trung gian TB, hoạt hóa các tế bào Th2 và sản sinh các đáp ứng thể dịch.

Khả năng điều chỉnh sự cân bằng này rất quan trọng đối với sự thành công của trị liệu miễn dịch ung thư. Vì các MoDC về mặt kiểu hình thì giống như các DCs/DDCs kẽ nên chúng dễ dàng được tiếp cận trong các mô hình in vitro để nghiên cứu và tinh chỉnh các quá trình này.

Các DC tương bào 

Mặc dầu trước đây được cho là góp phần vào việc chuyển hướng miễn dịch sang đáp ứng thể dịch typ 2, nhưng gần đây các PDC được mô tả là giải phóng ra một lượng lớn IFN-α khi được kích thích bởi CD40L và virus, do đó làm tăng đáp ứng của NK và CTL. Đặc trưng dưới này có thể được khai thác để nâng cao hiệu quả của việc tiêm phòng kháng u. Các PDC trực tiếp từ máu về các LN thông qua dẫn trung gian L-selectin. Chúng có thể nằm ở các LN trong trạng thái sẵn sàng, sàng lọc liên tục môi trường xung quanh những dấu hiệu của thâm nhiễm vi khuẩn hay virus. Cách khác là chúng có thể được tuyển mộ tới các LN, làm khô vị trí viêm nhiễm thông qua CXCR3. CXCR3 được biểu hiện trên bề mặt của các PDC và gắn với chemokine IP10 và Mig thu hút tế bào hiệu ứng.

Sự hiện diện các PDC “sense” của các vi khuẩn thông qua các receptor đặc hiệu như receptor 9 (toll-like receptor 9 – TLR9). TLR9 gắn với các trình tự CpG chưa methyl hóa có nguồn gốc từ DNA vi khuẩn và sau khi hoạt hóa PDC sẽ giải phóng ra IFN-α  và có thể cả IL-12.

Sự kích thích của CD40L cũng có thể gây cảm ứng cho các PDC giải phóng IL12. Tác động tổ hợp của IL-12 và IFN-α cũng thúc đẩy sự chín của các DC dòng tủy lân cận và vì thế mà kích thích xa hơn sự hoạt hóa tế bào T.

Việc sử dụng các CpG DNA như là chất bổ trợ trong tiêm phòng kháng u đang được khảo sát. CpG có khả năng làm “chuyển hướng” (skewing) tế bào T typ 1, các nghiên cứu trên chuột đã thể hiện rõ các lợi ích to lớn của sự loại trừ khối u. Tuy nhiên, vẫn đang tiếp tục với các nghiên cứu để liệu xem trên người có như vậy không và PDC có liên quan tới vấn đề này như thế nào.

Một mô hình khác của sự biểu hiện TLK trên các PDC và DC dòng tủy cũng được báo cáo. Sự biểu hiện TLR9 xuất hiện trên người là đặc hiệu PDC; còn sự biểu hiện của TLR4 gắn LPS thì chỉ giới hạn với các DC dòng tủy. Vì vậy, sự biểu hiện TLR biệt hóa cho phép đích và hoạt hóa đặc hiệu các PDC và DC dòng tủy cho miễn dịch trị liệu.

CÁC DC TRONG ĐIỀU HÒA HOẠT HÓA VÀ DUNG NẠP MIỄN DỊCH

Mồi và hoạt hóa tế bào T thích hợp là cần thiết đối với đáp ứng kháng u hiệu quả và các DC giữ vai trò  quan trọng trong quá trình này. Hoạt hóa miễn dịch không đầy đủ trong ung thư có thể được khắc phục bằng cách nâng cao chức năng DC ở cả pha ly tâm và hướng tâm của đáp ứng miễn dịch.

Sự nguy hiểm của hoạt hóa tế bào T

Các DC chưa chín liên hệ mật thiết với các TB lân cận và liên tục tìm kiếm những mối nguy hiểm trong vùng lân cận chúng. Những tình huống nguy hiểm tiềm tàng có thể được nhận ra bởi các DC là sự xâm nhập của virus, stress hay hủy hoại mô dẫn đến sự chết TB một cách bất thường. Các DC biểu hiện một kho vũ khí ấn tượng là các receptor để hỗ trợ chúng thực hiện chức năng này: receptor Fc (FcR), các receptor nhận dạng mẫu vi khuẩn (lectin và TLR), receptor protein sốc nhiệt (CD91) và receptor  scavenger có thể gắn với các thể hoại tử hoặc apoptosis (CD36 và α_vβ₃ và α_vβ₅-integrin).

Với sự tham gia của các receptor này và sự hấp thu kháng nguyên, các DC trở nên hoạt hóa, giải phóng sự cầm giữ của chúng đối với xung quanh và bắt đầu di trú khỏi mô ngoại biên. 

Các yếu tố cục bộ giữ vai trò  quan trọng trong cảm ứng quá trình này là TNF-α , IL-1β, GM-CSF, IL-18 và PGE2, chúng được giải phóng ở mức cao dưới điều kiện tiền viêm bởi các TB cư trú tại mô cũng như bởi chính các DC.

Các phân tử điều hòa xuống các DC hoạt hóa có liên quan tới sự bắt giữ kháng nguyên, các phân tử MHC điều hòa lên và khởi đầu biểu hiện các marker của sự chín (CD83, CMRF-44), các phân tử kết dính và đồng kích thích đều rất cần thiết cho sự hoạt hóa tối ưu các tế bào T (CD40, CD54, CD80, CD86, 4-1BBL). Đặc biệt là các DC hoạt hóa điều hòa xuống sự biểu hiện của CCR5 và CCR6 (các receptor chemokin liên quan đến sự dẫn về các mô ngoại vi không phải bạch huyết) và thay vì việc điều hòa lên sự biểu hiện CCR7, chúng lại gắn với các chemokin CCL19 và CCL21 nguồn gốc từ LN và tạo thuận lợi cho sự dẫn lối thông qua bạch huyết hướng tâm để tới khu vực tế bào T cận vỏ trong các LN. Tại đó, các DC có thể tương tác với các tế bào Th và CTL ghi nhớ và tự nhiên lưu thông liên tục.

Các DC có khả năng độc quyền trong việc hấp thu các kháng nguyên và xử lý chúng không những cho đại diện qua trung quan MHC lớp II mà còn cả với các đại diện CD8⁺ CTL của MHC lớp I. Quá trình hấp thu kháng nguyên ngoại sinh và xử lý cho sự hoạt hóa CTL đặc hiệu này được hiểu là sự mồi “bắt chéo”. Các DC sẽ hoạt hóa các tế bào T trên sự nhận diện đặc hiệu KN, chúng giám sát xa hơn nữa sự gắn kết DC/tế bào T.

CD40L trên các DC “siêu hoạt hóa” tế bào T có khả năng điều hòa lên xa hơn nữa các CD86 và sản xuất ra IL-12. Chúng là các điều kiện thiết yếu cho sự hoạt hóa tối ưu CTL.

Sự di trú tới các LN tối ưu vào ngày thứ 2 và các DC bên trong LN có tần số luân chuyển là 3-5 ngày. Các DC không rời khỏi các LN nhưng chắcònó phải trải qua quá trình apoptosis được bùng phát bởi sự tương tác với các CTL hoặc các tế bào NK. Các CTL hiệu ứng hoạt hóa rời khỏi các LN thông qua mạch ly tâm và xâm nhập vào các vị trí viêm nhiễm để loại đi các TB đã bị thâm nhiễm hoặc các TB khối u như trường hợp này chẳng hạn.

Các DC cũng giữ vai trò  quan trọng trong pha ly tâm của đáp ứng miễn dịch do sự tương tác với các tế bào T hiệu ứng nhằm duy trì sự hoạt hóa của chúng và ngăn chặn apoptosis sớm. Trong các khối u vấn đề này đặc biệt thích hợp, trong khi các tế bào T nhạy cảm với apoptosis qua trung gian Fas (cảm ứng bởi FasL biểu hiện trên các TB khối u, quá trình này được hiểu là sự “phản công”) thì các DC lại kháng lại và có thể trở nên hoạt hóa thông qua “lời đảm bảo” của Fas trên bề mặt TB của chúng, vì thế mà tạo thuận lợi cho chức năng bảo vệ tế bào T của chúng.

Các cách tiếp cận nhắm vào các DC khác nhau cho gen trị liệu ung thư có thể được hình dung là sự điều chỉnh các chức năng của DC ở bất kỳ giai đoạn nào của đáp ứng miễn dịch kháng u. Sự cải biến di truyền trị liệu của các DC (hoặc các TB lân cận chúng) giúp làm tăng sự hấp thu kháng nguyên, sự chín của DC và sự trở về các LN, làm mạnh thêm và kéo dài tương tác DC/tế bào T, hoạt hóa tế bào T cũng như sự thấm nhập DC vào các vị trí (hiệu ứng) u.

Ung thư: sự dung nạp, kiềm chế và thiếu nhận thức

Các đáp ứng miễn dịch đặc hiệu khối u thường chưa thể phát hiện được cho đến tận giai đoạn muộn của bệnh và sau đó thường là bất lực với kiểm soát tăng trưởng khối u vì gánh nặng với chúng rất lớn. Sự tăng sinh khối u nằm ngoài tầm kiểm soát, còn các TB hiệu ứng miễn dịch thì chưa bắt kịp. Hơn nữa, khi ung thư đã tiến triển thì các cytokin kiềm chế bắt nguồn từ khối u mới ở mức cao trong hệ thống nên làm giảm chức năng hiệu ứng miễn dịch và kiềm chế miễn dịch kháng u. 

Vậy tại sao các DC lại không hành xử đúng đắn và cảnh báo kịp thời cho hệ miễn dịch về những nguy hiểm của khối u để rồi tác động ? Có nhiều khả năng như sau:

Mô khối u không cung cấp các tín hiệu nguy hiểm cần thiết và chỉ đơn thuần được cảm nhận bởi các DC như thể là cần phải duy trì trạng thái “ổn định” của một mô bình thường kháng lại sự dung nạp thông thường. Chỉ đến khi các khối u đã đạt đến một kích cỡ xác định mà ở đó quá trình tạo mạch đã trở nên không đầy đủ và sau đó là giảm oxy huyết và kết quả cuối cùng có thể là tăng các mức apoptosis và hoại tử thì khi đó các DC thanh lọc (scavenging) mới cảm nhận thấy sự nguy hiểm và trở nên hoạt hóa. Đáng tiếc là, đây là thời điểm quá muộn đối với các TB hiệu ứng miễn dịch để theo kịp sự tăng sinh của các TB khối u.

Một cách giải thích khác là hiện tượng thiếu nhận thức miễn dịch (immunological ignorance) là nhiều khối u đặc đã bị khép chặt và kháng lại sự xâm nhập bởi các DC. Do vậy mà các DC không truy cập được kho TÁA hoặc  bất kỳ tín hiệu nguy hiểm liên kết khối u nào và cuối cùng không có khả năng vận chuyển TAA tới LN tiêu khối u để bắt đầu một đáp ứng miễn dịch. Hệ thống miễn dịch này như vậy ở trạng thái thiếu hiểu biết về khối u cho đến tận lúc ranh giới của nó bị phá vỡ và xảy ra sự di căn. Lại một lần nữa cho thấy, tại thời điểm này là quá muộn để hệ miễn dịch tác động một cách hiệu lực.

Sau chót là, sự chín của DC có thể bị kiềm chế tích cực bởi các yếu tố có nguồn gốc từ khối u và sự hoạt hóa đặc biệt tế bào T cuối cùng bị phá vỡ. Các mức cao của IL-10 liên quan tới môi trường khối u có lẽ là thủ phạm chính. IL-10 cũng can thiệp vào sự di trú của các DC đặc biệt  tới các LN thông qua điều hòa xuống của CCR7 và cảm ứng của CCR5 và CCR6. Cuối cùng là, sự tiếp xúc với các DC được kích thích bởi IL-10 cũng can thiệp vào chức năng hiệu ứng tế bào T. Trong vi môi trường khối u, tất cả nhứng quá trình này có thể tác động trong sự h a tấu giữa kiềm chế miễn dịch và tiến triển của khối u.

Để có được hiệu quả, trị liệu miễn dịch bắt buộc phải kết nối khối u và hệ thống miễn dịch khi tiền viêm để đảm bảo chắc chắn cho sự hoạt hóa tế bào T đặc hiệu TAA và các DC đặc biệt. Hơn nữa, cũng cần kháng lại hiệu ứng kiềm chế miễn dịch của các yếu tố có nguồn gốc từ khối u.

CÁC DC TRONG UNG THƯ

Cản trở sự biệt hóa và sự chín của DC đã được báo cáo ở nhiều khối u và việc làm giảm sự thâm nhiễm khối u bởi các DC đã được xác định như là một yếu tố dự báo nói chung. Tuy nhiên, việc phát triển và tạo chức năng cho các DC bị lỗi phải được khắc phục trước khi thực hiện trị liệu ung thư in vivo đích bởi DC. Trong chương này chúng tôi sẽ đề cập các cơ chế khác nhau trong đó khối u can thiệp vào sự biệt hóa và sự chín của DC.

Phân bố sự biệt hóa DC

Giảm tần số của các PBDC cùng với giảm mức các phân tử đồng kích thích đã được báo cáo ở nhiều bệnh nhân ung thư vú tiến triển. Tuy vậy, vẫn còn các PBDC chức năng suy yếu nhưng vẫn có khả năng kích thích tế bào T. Trong một nhóm các bệnh nhân bị u đầu và cổ, ung thư phổi không tế bào nhỏ hoặc ung thư vú người ta quan sát thấy tăng lượng tế bào tiền thân PBDC dòng tủy CD11c ^- chưa chín, điều đó cho thấy sự biệt hóa DC dòng tủy đã bị ức chế ở các giai đoạn sớm của sự phát triển. Những yếu tố có nguồn gốc từ các khối u khác nhau cũng liên quan tới sự ức chế biệt hóa DC:

VEGF: cả trong các mô hình biệt hóa CD34DC in vitro và các mô hình khối u in vivo đều cho thấy VEGF ngăn chặn (khóa) sự biệt hóa DC ngay ở các giai đoạn đầu của sự phát  triển. Mức tăng số lượng CD11c ^- PBDC chưa chín tương quan với mức tăng VEGF huyết tương. Một công trình nghiên cứu chứng minh rằng cơ chế phân tử đáng chú ý nhất về sự ức chế cảm ứng gây bởi VEGF đối với sự biệt hóa DC có thể là sự ức chế biểu hiện phụ thuộcònF-kB của histon H1°. Sự xuất hiện của histon H1° liên quan đặc biệt tới biệt hóa DC. Sự phiên mã H1° có thể bị ngăn chặn bởi các DC đang biệt hóa do các dịch nổi (supeRNAtant) có nguồn gốc từ các dòng tế bào khối u.

IL-6: sự biệt hóa của các CD34-DC, ngoại trừ các MoDC có thể bị ức chế in vitro bởi IL-6 có ở phần dịch nổi có nguồn gốc hoặc từ các dòng TB khối u hoặc từ các khối u nguyên phát.  IL-4 thì kháng lại hiệu ứng kiềm chế của IL-6 và vì thế mà nó là một cytokin hấp dẫn được sử dụng trong các protocol  trị liệu miễn dịch với mục đích nâng cao chức năng của DC trong các môi trường khối u.

M-CSF: macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) cũng thể hiện là chất ức chế biệt hóa DC. Thực vậy, ít nhất là IL-6 có cảm ứng phần nào với hiệu ứng kiềm chế DC đã quan sát thấy ở dòng TB khối u có nguồn gốc từ dịch nổi và  nó được gán cho là sự biểu hiện cảm ứng thứ cấp của M-CSF. IL-4 có thể kháng lại hiệu ứng kiềm chế, điều đó giải thích phần nào về sự mất khả năng của IL-6 và M-CSF đối với việc ức chế biệt hóa MoDC bởi vì quá trình này phụ thuộc hoàn toàn vào IL-4.

Ganglioside: ganglioside là các lipid có nguồn gốc từ các neuron. Chúng được  giải phóng ở mức cao từ các TB u nguyên bào thần kinh. Các ganglioside bắt nguồn từ dòng TB u nguyên bào thần kinh thể hiện ức chế sự biệt hóa DC từ các TB tổ tiên CD34⁺.

IL-10:  cả in vitro và in vivo, IL-10 được báo cáo là gây cản trở nghiêm trọng đối với sự biệt hóa DC. Sự sút kém trong biệt hóa DC cùng với giảm biểu hiện CD40 đã được chứng minh ở mô hình khối u trên chuột. Các DC kiềm chế này làm giảm đáng kể lượng IL-12 được giải phóng ra dưới sự kích thích của CD40L. Sự ức chế cảm ứng của khối u đối với chức năng và kiểu hình của các DC có thể đảo ngược được bằng cách xử lý hệ thống với các kháng thể IL-12 hoặc với FLT3L và/hoặc CD40L.

Prostaglandin: các  prostaglandin điều hòa bởi cycloxygenase-2 được báo cáo là yếu tố ức chế biệt hóa DC chủ yếu trong các dịch nổi nuôi cấy 24 giờ các TB ung thư: u sắc tố, ung thư kết tràng, ung thư vú và ung thư thận. Các prostaglandin có nguồn gốc từ khối u là đáp ứng chỉ quan sát thấy trong ức chế cảm ứng khối u do biệt hóa MoDC và cùng với IL-6, nó lại ức chế sự biệt hóa CD34-DC. Ngoài việc ngăn chặn biệt hóa, các prostaglandin bắt nguồn từ khối u còn chuyển hướng các DC về phía ưa giải phóng ra IL-10 hơn là IL-12 khi được kích thích bởi CD40L. Với việc xử lý bằng các chất ức chế cyclooxygenase – 2 đặc hiệu, các nghiên cứu sâu rộng hiện nay về hiệu ứng kháng tạo mạch và kháng u hy vọng có thể làm giảm bớt được các hiệu ứng ức chế biệt hóa DC này của các prostaglandin.

Rối loạn sự chín của các DC

Trong các u vú người ta thấy DC chín CD83⁺  bị bao vây còn CD11a⁺ DC chưa chín thì lại xâm nhập được vào các khối u. Điều này gợi lên rằng có sự ức chế qua trung gian khối u đối với sự chín của DC. Phù hợp với vấn đề này là các DC được phân lập từ các khối di căn của u sắc tố có kiểu hình DC chưa chín và cảm ứng sự dung nạp tế bào T. Các DC trong hạch lympho mà khối u không tồn tại nữa cũng thể hiện các đặc trưng chưa chín. IL-10 dường như có nguồn gốc từ khối u là thủ phạm của ức chế sự chín. Mặc dầu vậy,  PGE2 có thể cảm ứng biểu hiện IL-10 và vì vậy mà chỉ gây ảnh hưởng tới sự chín của DC chứ không ngăn chặn trực tiếp sự chín của DC. Thật ra PGE2 có thể nâng cao hiệu ứng của các tác nhân gây chín DC khác và dẫn đến điều hòa xuống CD83 và CD86, mặc dầu nó có thể chuyển hướng của các DC chín tới việc sản sinh IL-10 và có kiểu hình dung nạp tế bào T. Hiệu ứng tổng thể của các yếu tố hòa tan có nguồn gốc từ khối u lên sự chín của DC do vậy được chi phối bởi IL-10, như ức chế biểu hiện CD83 và các marker đồng kích thích, xáo trộn sự dịch chuyển tới các LN, giảm IL-12 và tăng giải phóng IL-10 và cuối cùng dẫn tới cảm ứng tính không dị ứng của tế bào T hoặc hoạt hóa điều hòa các tế bào T. Các hiệu ứng qua trung gian Il-10 này có thể bị mất tác dụng bởi sự điều phối của CD40L và /hoặc CM-CSF.

Apoptosis DC cảm ứng bởi  khối u 

Các DC cuối cùng sẽ phải trải qua apoptosis ở các LN sau khi  chúng trình diện các kháng nguyên lên vùng tế bào T cận vỏ (paracortical). Thực vậy, các DC  có thể trải qua apoptosis được cảm ứng bởi chính các CTL mà chúng hoạt hóa. Vì thế apoptosis là một phần tự nhiên của chu kỳ sống DC. Tuy nhiên, apoptosis sớm của DC có thể lại can thiệp vào sự hoạt hóa các tế bào T đặc biệt. Thật vậy, thời gian tối thiểu xác định của tương tác DC/tế bào T là nhu cầu đòi hỏi để sản sinh các đáp ứng CTL hiệu ứng tối ưu. Mặc dầu các DC kháng tự nhiên với apoptosis do cảm ứng bởi Fas, nhưng các yếu tố bắt nguồn từ các u lỏng như các ceramid và cyclopentenon prostsglandin lại có thể cảm ứng apoptosis sớm trên các DC và vì thế mà can thiệp vào các chức năng hoạt hóa tế bào T.

Kháng apoptosis có thể được tăng cường bằng cách xử lý các DC với GM-CSF, CD40L, TNF-α hoặc LPS, chúng điều hòa xuống bcl-2 hoặc blc-X (L). DC40L và LPS cũng có thể làm tăng biểu hiện các chất ức chế caspase – được hiểu là kháng apoptosis cảm ứng bởi granzym (serpin, murin SPI-6 hoặc human PI-9).  Một cách khác nữa là các DC có thể được cải biến di truyền để cảm ứng sự biểu hiện các phân tử kháng apoptosis và vì thế mà kéo dài và nâng cao chức năng kích thích tế bào T của chúng.

MIỄN DỊCH TRỊ LIỆU UNG THƯ THÔNG QUA ĐIỀU TIẾT CHỨC NĂNG DC

Trong phần này chúng ta sẽ bàn luận về các chiến lược đích các DC và việc điều tiết các chức năng miễn dịch của chúng cho trị liệu miễn dịch ung thư.

Các cytokin kích thích DC: nâng cao các đặc thù

Trị liệu gen cytokin có thể trợ giúp kháng lại các hiệu ứng kiềm chế DC bằng cách tăng lượng DC (toàn hệ thống hoặc trong khối u), tăng cường biệt hóa hoạt hóa và các chức năng tổng thể của chúng: làm như vậy thì việc trị liệu cytokin có thể chuyển đổi một cách hiệu quả các sự kiện mồi chéo (cross-priming) trong các khối u từ dung nạp đến hoạt hóa tế bào T. Việc thiết kế bổ trợ sẽ làm tăng thêm thành công đặc thù trên bất kỳ dạng miễn dịch trị liệu ung thư nào, đặc biệt là phương pháp đích bởi DC in vivo. Bằng việc điều chỉnh các gen cytokin hơn là các protein, hiệu ứng kích thích DC đạt mức mong muốn có thể được duy trì trong thời gian dài và trong một số trường hợp còn cho hiệu ứng cao hơn.

Các cytokin có thể tác động tới các giai đoạn khác nhau của quá trình biệt hóa và chín của các DC. FLT3L, IL-3, G-CSF và GM-CSF có thể tác động như các yếu tố tăng trưởng, làm tăng tổng thể số tế bào tiền thân DC. Trong khi  FLT3L, IL-3 và GCSF làm tăng số lượng cả các tiền thân PDC cũng như các DC dòng tủy thì GM-CSF chỉ thúc đẩy đặc biệt sự tăng sinh của các tiền thân dòng tủy. Điều quan trọng là các tiền thân DC được huy động bởi G-CSF lại biệt hóa thành các DC, tăng cường ưu tiên miễn dịch typ 2, trong khi các tiền thân DC được huy động bởi GM-CSF lại biệt hóa thành DC, tăng cường miễn dịch trung gian tế bào typ 1. GM-CSF, IL-4, IFN-α, IFNβ,  IFN-β và IL-3 có thể làm tốt hơn nữa biệt hóa của các DC, nếu tổ hợp lại các cytokin khác nhau này sẽ dẫn đến biệt hóa chức năng và kiểu hình của các tiểu quần thể DC khác nhau. GM-CSF, IL-4, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TN-α, IL-1β và IL-18 có thể làm tăng sự chín DC in vivo và tạo thuận lợi cho việc di trú của các DC chín tới các tổ chức lympho thứ cấp.

Cách phân phối và sử dụng thuốc của các cytokin phụ thuộc vào giai đoạn đích tăng trưởng DC: chẳng hạn như ở các vị trí có thể đi vào tuần hoàn đòi hỏi phải có những liều tương đối cao để có hiệu ứng hệ thống đối với tăng sinh và  biệt hóa các tiền thân DC; phân phối cục bộ với các liều thấp hơn có thể thích hợp hơn đối với sự chín của các DC cũng như kích thích hoạt hóa tế bào T trong vùng lân cận khối u cũng như ở các vị trí tiêm chủng. Đối với các mô hình điều trị tiền lâm sàng ung thư in vivo và các thiết kế lâm sàng, các gen cytokin kích thích DC đã được chuyển giao nhờ các plasmid DNA trần hoặc các vec tơ virus và thông thường hơn cả là adenovirus hoặc virus vaccinia.

Để tăng cường các chức năng của các DC cũng như kích thích miễn dịch tế bào T đặc hiệu khối u, các vec tơ có mang các gen cytokin được tiêm trực tiếp vào các khối u hoặc được chuyển giao tới các tế bào khối u tự thân hoặc các dòng tế bào khối u dị loại (allogeneic) in vivo và điều hành như một như một vaccin khối u đã được nâng cao về mặt sinh học. Một cách khác là các DC dị loại được tạo ra in vitro sẽ được tải nạp với các gen cytokin (thường là kết hợp cùng với gen TAA) rồi tiêm ở xa khối u (thường là trong lớp bì) hoặc tiêm thẳng vào các khối u.

GM-CSF: GM-CSF là một cytokin thường hay được sử dụng nhất để làm tăng miễn dịch kháng u. Như chúng ta đã biết, để kích thích các DC ở hầu hết các giai đoạn của sự phát triển và hoạt hóa của chúng bằng cách huy động các tiền thân DC tới máu và các DC đã biệt hóa tới vị trí xử lý chỉ có cách là hoạt hóa chúng, kích thích sự di trú của chúng tới LN và hỗ trợ chúng tăng đề kháng với apoptosis. Các vec tơ mang các gen GM-CSF đã được sử dụng để tải nạp các tế bào khối u và các DC cho sự hoán chuyển adoptive, nhưng cũng có thể tiêm trực tiếp (có hoặc không có gen TAA) in vivo. Tất cả những cách tiếp cận này đã mang lại kết quả là miễn dịch kháng u hiệu quả và mạnh mẽ ở các mô hình trên chuột. GM-CSF có thể tác động như một tín hiệu danger và thường được sử dụng như một chất bổ trợ trong các protocol tiêm phòng kháng u. Tổ hợp cùng với các cytokin khác (IL-4 và FLT3L) hoặc với các tác nhân gây chín (CD40L) có thể nâng cao hơn nữa hiệu lực của nó với tư cách là chất bổ trợ miễn dịch.

IL-4: các dòng tế bào khối u tải nạp hoặc các nguyên bào sợi tự thân được hợp nhất hay trộn lẫn với các DC tự thân đã làm tăng cường miễn dịch kháng u. IL-4 được đưa vào cùng với yếu tố kích thích quần thể đại thực bào - bạch cầu hạt (GM-CSF) đã làm tăng sự chín của DC cả hệ thống cũng như cục bộ. Hơn nữa, IL-4 cũng có thể bảo vệ biệt hóa DC khỏi các hiệu ứng bất lợi.

TNF-α  là một chất cảm ứng gây chín DC tiềm năng và là một chất trung gian “mediator” của sự di trú DC. Đồng tải nạp DC với các adenovirus mã hóa Her-2/neu và TNF-α sẽ làm tăng sự chín và cảm ứng hiệu quả hơn miễn dịch kháng u sau khi tiêm dưới da ở mô hình u kết tràng trên chuột.

INF-α  từ trước tới nay vẫn là một cytokin ứng cử viên với tư cách bổ trợ trong trị liệu miễn dịch. Nó có hiệu ứng gây chín DC mạnh cả in vitro và in vivo, kích thích sự di trú DC khỏi da. Tiêm chủng với các tế bào khối u tải nạp IFN-α sẽ làm tăng sự thấm nhập DC và loại thải các khối u đã được hình thành trong mô hình ung thư kết tràng trên chuột.

IL-18: để kích thích miễn dịch khối u qua trung gian TB hiệu ứng, các DC thường được tải nạp bởi các gen mã hóa các cytokin kích thích Th1/CTL chẳng hạn như IL-12, IL-15 và IL-18. Trong một mô hình ung thư trên chuột, bằng việc chuyển giao IL-18 qua trung gian adenovirus đã làm tăng sự chín của DC một cách đặc hiệu, sau khi tiêm chủng với peptid đơn cảm ứng toàn bộ tế bào T hiệu ứng thông qua quá trình thúc đẩy DC do sự trải rộng epitope.

CCL21: một phát triển thú vị trong trị liệu miễn dịch ung thư là tải nạp các DC tự thân với CCR7 ligand CCL21/SLC. Sau khi tiêm vào khối u các DC tải nạp CCL21, qua trung gian CTL đã chiêu mộ được cả tế bào T và DC. Trên thực tế, CCL21 đã tạo cho các DC vi môi trường thích hợp để sản sinh ra các đáp ứng miễn dịch kháng u, sẵn sàng truy nhập tới TAA và hoạt hóa các CTL hiệu ứng ở vị trí chính xác chúng cần.

Cải biến gen các DC để biểu hiện TAA

Thay vì nâng cao khả năng thành công của việc mồi chéo CTL kháng u qua trung gian DC bằng việc chuyển giao in vivo các gen cytokin kích thích, các DC có thể được tải nạp trực tiếp để biểu hiện TAA. Để hoạt hóa được CTL bằng các DC tải nạp TAA, ít nhất phải có 2 điều kiện: (1) phải đủ số lượng DC biểu hiện  cao các kháng nguyên TAA đích (hiệu ứng tải nạp DC thích hợp) và (2) hoạt hóa thích hợp và đủ các DC tải nạp.

Chọn vec tơ

Chọn vec tơ cho việc tải nạp các DC rất quan trọng. Một số vec tơ (virus) có thể ảnh hưởng tới hoạt hóa DC bởi ức chế hay kích thích nó hoặc có thể làm biến đổi khả năng tải nạp của các DC (tiền thân). Các đặc trưng của các vec tơ virus và không virus khác nhau thích hợp với việc tải nạp DC hiệu ứng được liệt kê ở Bảng 9.1 dưới đây.

Các thế hệ mới nhất của các vec tơ virus (đã được làm suy yếu) được thiết kế cho các mục đích gen trị liệu là khiếm khuyết sao chép và tính sinh miễn dịch kém do đã loại bớt các protein cấu trúc. Thâm nhiễm DC với các vec tơ virus đã thu được các hiệu ứng tải nạp DC khá cao so với thâm chuyển với DNA hoặc RNA trần. Điều này làm cho các virus trở nên hấp dẫn với tư cách là các phương tiện vận chuyển gen cho các DC. Hạn chế chủ yếu của việc sử dụng các virus là nó đã có miễn dịch từ trướcònên có thể ảnh hưởng tới hiệu quả thâm nhiễm và tuổi thọ của các DC tải nạp, và có thể là các virus có các cách phát triển để phá hoại ngầm các chức năng của DC bằng cách lẩn trốn miễn dịch. Trái lại, các vaccin DNA hay RNA trần thì không làm ảnh hưởng tới sự chín  của DC, chúng lại không có tính sinh miễn dịch và việc sản xuất lại dễ dàng và rẻ tiền. Những kết quả đạt được cho đến ngày nay đối với tải nạp DC với các hệ thống virus khác nhau sẽ được bàn luận tiếp theo.

Các virus DNA

Adenovirus: một trong số các vec tơ chuyển gen thường hay dùng nhất đối với DC là adenovirus typ 5 (Ad5). Các adenovirus tăng trưởng một cách dễ dàng để đạt tới các độ chuẩn cao và có hiệu ứng cao trong chuyển gen độc lập với sự sao chép của tế bào chủ. Điều này rất quan trọng bởi vì các DC đã được biệt hóa đầy đủ và các tiền thân trực tiếp của chúng đã mất tiềm năng tăng sinh. Hơn nữa, các DC thâm nhiễm bởi các vec tơ Ad5 mã hóa TAA đã sử dụng thành công trong việc tạo ra các đáp ứng tế bào T kháng u cả in vivo và in vitro và tiêm chủng với các DC tải nạp Ad dẫn đến loại thải khối u ở các mô hình trên chuột. Mặc dầu có những lợi thế như vậy nhưng các DC cũng kháng tương đối với sự thâm nhiễm Ad5. Trong các nghiên cứu in vitro với MoDc thấy có thay đổi, nhưng nhìn chung chỉ ở mức thấp đến trung bình. Hiệu ứng tải nạp của Ad5 (khoảng 20-30% bội nhiễm [MOI] 100). Điều này có lẽ là do vắng các receptor adenovirus và receptor Ad5 mồi trên bề mặt DC, mặc dầu các integrin cần cho thực ẩm bào  (endocytosis) của các virus thì đã biểu hiện.

Chỉ ở các độ chuẩn virus cực kỳ cao (MOI > 1000 tức là 1000 plaque-forming unit [pfu]/tế bào và thời gian thâm nhiễm in vitro kéo dài (> 1 giờ) hoặc được tổ hợp cùng với các liposome thì mới có thể vượt qua được sự đề kháng tương đối đối với thâm nhiễm Ad5. Thay thế những núm sợi Ad5 bằng Ad35 (receptor có vẻ như được biểu thị trên các DC) sẽ làm tăng đáng kể hiệu ứng tải nạp DC cũng như sự hợp nhất của trình tự Arg-Gly-Asp (RGD) (nó có thể gắn với các integrin α_vβ₃   và   α_vβ ₅ biểu hiện trên các DC chưa chín) thành vòng HI của núm sợi Ad5. Tái đích Ad5 tới CD40 bằng việc sử dụng một chất bổ trợ kháng thể đặc hiệu kép gắn cả với núm sợi Ad5 và cả CD40 trên bề mặt DC do vậy mà làm tăng hiệu ứng tải nạp DC tới 95% ở độ chuẩn MOI 100.

Cũng có một số báo cáo công kích lại các số liệu liên quan tới khả năng của các vec tơ adenovirus đối với sự hoạt hóa DC chưa chín.  Một số báo cáo nêu rõ có sự cảm ứng chín đầy đủ (điều hòa lên các phân tử đồng kích thích, cảm ứng sản xuất IL12); một số lại quan sát thấy có sự trưởng thành kiểu hình không đầy đủ (điều hòa lên HLA-DR và CD86). Một số khác lại không quan sát thấy bất kỳ hiệu ứng nào. Cuối cùng là một báo cáo về hiệu ứng kiềm chế miễn dịch của các DC chín được tải nạp adenovirus. Những quan sát khác nhau này có thể được giải thích là do sự khác biệt về type của adenovirus, các phương pháp thâm nhiễm và nguồn các DC được sử dụng.

Virus liên kết adeno (adeno-associated virus –AAV): AAV là các parvovirus nhỏ, không gây bệnh nhưng phụ thuộc rất lớn vào các virus trợ giúp (helper) như các adenovirus cho sự sao chép của chúng. AAV thâm nhiễm các DC với tỷ số khoảng 50% ở MOI 100, tăng tới 90% ở MOI 300. Sự thâm nhiễm AAV không làm ảnh hưởng tới khả năng kích thích tế bào T và không cản trở cảm ứng chín kế tiếp. Sự thâm nhiễm AAV sẽ làm tăng biểu hiện CD80 và CD83, nhưng lại ức chế biểu hiện CD86. Các DC tải nạp AAV có thể cảm ứng đáp ứng Th và CTL đặc hiệu kháng nguyên, nhưng hiệu ứng trị liệu khối u in vivo của chúng thì vẫn cần phải chứng minh.

VV:  VV là một thành viên của họ virus orthopox. VV có thể thâm nhiễm các DC một cách hiệu lực ở các MOI thấp (hiệu ứng tải nạp của các DC chưa chín ở MOI 2,5 là 60%). VV là các virus ly giải nên việc sử dụng chúng in vivo tương đối an toàn, việc tiêm chủng kháng u trên nền tảng VV hiện nay đang được khảo sát. Các DC tải nạp VV có thể cảm ứng với cả đáp ứng Th và CTL đặc hiệu TAA dẫn đến loại thải khối u in vivo. Tuy nhiên, sự thâm nhiễm VV lại ảnh hưởng tới sự chín của các DC đặc biệt, điều hòa xuống CD83 và các phân tử đồng kích thích khác, đồng thời cản trở kích thích tế bào T. Để tháo gỡ vấn đề này, các DC phải được làm chín trước khi chúng được tải nạp với VV in vitro. Để tạo thuận lợi cho quá trình xử lý của MHC lớp II và trình diện gen chuyển sau khi chín, các vec tơ VV phải được thiết kế sao cho biểu hiện được gen chuyển trong sự kết hợp với trình tự đích protein màng liên kết lysosom. Các DC chín thâm nhiễm với các vec tơ này sẽ hoạt hóa hiệu quả cả Th và CTL.

Virus herpes simplex (HSV):  các HSV là các virus DNA mạch thẳng, lớn của HSV typ 1 (HSV-1) có thể thâm nhiễm DC với hiệu ứng trung bình đến cao. Những HSV khiếm khuyết sao chép hay các HSV có thể đã trải qua một vòng thâm nhiễm (thâm nhiễm tái tổ hợp không đầy đủ HSV-1 với chu kỳ đơn) là cách  tế bào ảnh hưởng tới sự chín DC dẫn đến điều hòa xuống sự biểu hiện CD83 và CD86 cũng như cản trở sự di trú của DC. Hơn nữa, các virus trợ giúp (helpervirus) có thể làm nhiễm các kho dự trữ HSV cũng có hiệu ứng kiềm chế miễn dịch đáng kể. Các  HSV amplicon là các vec tơ virus cơ sở plasmid được đóng gói trong các capsid của HSV-1 đã tạo được các hệ thống phân tử phi helpervirus và vì thế mà thích hợp hơn với việc thâm nhiễm DC.

HSV-1 amplicom cảm ứng chín DC với hiệu ứng cao (70-90 ở MOI 1) và không phải là con đường tế bào kích thích CD80, CD86 và CD40 với các mức DC chưa chín. Các DC được tải nạp bằng HSV amplicon cảm ứng CTL đặc hiệu khối u và là trung gian thải loại khối u in vivo. Hơn nữa, vì hệ gen HSV lớn nên sẽ cho phép bao gộp được nhiều gen có thể kích thích miễn dịch xa hơn (CD40L, GM-CSF và CCL21).

Bảng 9.1. Các đặc trưng của các vec tơ virus và không virus dùng để chuyển gen tới các DC

Ghi chú :  ND = không xác định

a = thang cao nhất của các hiệu ứng tải nạp

b = thu được bằng thâm chuyển qua trung gian cationic peptid hay liposom hoặc bằng điện chuyển

c = sóng điện chuyển 

d = khả năng sống của tế bào đích có thể bị giảm đi do điện chuyển e = tương phản

f = điều hòa xuống CD80 và Cd83, nhưng phải đi cùng với điều hòa xuống CD86

g = có thể hoạt hóa các tiểu quần thể DC xác định khi đã có các trình tự CpG  ở bên trong

h = giảm kích thích tế bào T dị loại sau khi thâm nhiễm MoDC với adenovirus 

I = HSV có  khả năng kiềm chế cao; điều này bị hủy bỏ khi dùng amplicon.

Các virus RNA

Retrovirus: các retrovirus hay được dùng nhất cho việc tải nạp DC là các virus tái tổ hợp bệnh bạch cầu của chuột khiếm khuyết sao chép. Lợi thế chủ yếu của các vec tơ này là chúng không có khả năng tải nạp các TB không phân chia. Điều này làm cho chúng không thích hợp với việc tải nạp các MoDC, nhưng chúng lại có thể thâm nhiễm được các tiền thân CD34⁺DC đang tăng sinh để có thể biệt hóa tiếp theo thành các DC. Vì vậy chỉ đạt được hiệu ứng tải nạp DC tương đối thấp từ 10-20%. Việc cải tiến nâng cấp các protocol  bao gồm việc sử dụng retronectin, ly tâm, lặp đi lặp lại các chu kỳ thâm nhiễm đã nâng hiệu ứng tải nạp lên tới 70%. Tải nạp retrovirus của các DC không làm ảnh hưởng tới sự chín sau này và có thể tiến tới hoạt hóa đáp ứng cả với Th và CTL. Sự hoán đổi adoptive của các DC, việc tải nạp bởi các retrovirus mã hóa TAA có thể cảm ứng sự  thải loại khối u in vivo.

Lentivirus: DC là các đích tự nhiên đối với virus gây thiếu hụt miễn dịch trên người và các virus gây thiếu hụt miễn dịch trên khỉ. Những vấn đề liên quan đến an toàn rõ ràng là những vấn đề chủ chốt trong việc phát triển các vec tơ lentivirus dùng cho trị liệu miễn dịch. Tuy nhiên, thế hệ thứ 3 của các vec tơ thì  lentivirus đã bị bất hoạt tới mức cực đại, đáp ứng được các ràng buộc về an toàn lâm sàng và tải nạp DC với các hiệu ứng cao (85-90% ở MOI <10). Các lentivirus có thể tải nạp được các tế bào không phân chia vì thế chúng thích hợp cho việc tải nạp MoDC nhưng lại không ức chế sự chín của DC. Các DC được tải nạp với lentivirus có thể hoạt hóa một cách hiệu quả các CTL, nhưng vẫn chưa có các nghiên cứu về sự loại thải khối u in vivo để thể hiện được hiệu lực trị liệu của chúng.

Các virus alpha: virus alpha là một nhóm virus RNA sợi đơn bao gồm cả Semliki Forest virus (SFV), virus gây viêm não ngựa Venezuela, virus Sindbis. Các vec tơ có nguồn gốc từ virus alpha dùng cho chuyển gen không mã hóa các protein cấu trúc và chỉ trải qua một chu kỳ thâm nhiễm. Chúng không mã hóa replicase RNA của virus, điều đó cho phép khuếch đại tế bào chất của vec tơ RNA vì vậy mà làm tăng sự biểu hiện gen chuyển. Những vec tơ này được hiểu như là các RNA replicon hoặc vaccin RNA tự sao chép và rất hiệu ứng trong cảm ứng loại thải khối u qua trung gian CTL. Chúng có thể được sử dụng như các RNA trần hay DNA bổ cứu, hoặc chúng có thể được hợp nhất vào các capsid của virus. Các hạt virus replicon có thể thâm nhiễm các TB không phân chia, các RNA replicon của chúng không thể hợp nhất được vào hệ gen vật chủ và vì chúng là virus ly giải nên cho phép mồi chéo xa hơn. SFV replicon có thể tải nạp hiệu quả các DC (hiệu ứng tải nạp đạt 80%) và có thể cảm ứng sự chín LC với việc điều hòa xuống các mức MHC lớp I và II, CD54 và CD80. Thật thú vị là virus replicon gây viêm não ngựa Venezuela dường như cũng có khả năng đích các LC một cách đặc hiệu in vivo.

DNA và RNA trần

DNA: Những DC được tải nạp bằng DNA trần có tỷ lệ rất thấp in vitro. Điện chuyển hay tạo phức với cationic peptid hoặc chuyển giao qua trung gian liposom có thể làm tăng hiệu ứng thâm chuyển tới 10-20%. Bản thân các DNA thì không hoạt hóa được DC, nhưng khi gộp với các trình tự CpG chưa methyl hóa thì có thể nâng cao tính sinh miễn dịch của các vaccin DNA, có lẽ là do hoạt hóa PDC và LC in vivo. Tạo các stress cơ học kết hợp với việc phân phối DNA thông qua phương pháp bắn đạn gen cũng làm cảm ứng gây chín DC.

Tiêm chủng DNA được báo cáo là sẽ dẫn đến hoạt hóa CTL đặc hiệu TAA in vivo. Sự hoạt hóa bổ sung sau khi tiêm phòng DNA in vivo rất có thể do các sự kiện mồi chéo. Chỉ cần thâm nhiễm một lượng rất thấp DC in vivo (tiêm trong da hoặc trong cơ) đã đủ để loại thải khối u qua trung gian CTL.

RNA: mRNA mã hóa TAA có thể được sử dụng để thâm chuyển DC in vitro. Khi kết hợp điện chuyển sóng vuông (aquare – wave electroporation) sẽ cho hiệu ứng thâm chuyển MoDC và CD34-DC tới mức 50-60%. Các trình tự gen miễn dịch có thể được hợp nhất vào trong các vaccin RNA để nâng cao hoạt hóa miễn dịch. Các DC tải nạp RNA có thể mồi hiệu quả CTL đặc hiệu TAA in vitro; khi được điều phối in vivo chúng có thể cảm ứng gây thải loại khối u.

Dựa trên các kết quả khích lệ này và nhìn vào độ an toàn tương đối về di truyền của việc sử dụng RNA mà các thử nghiệm lâm sàng với các MoDC tự thân được thâm chuyển với RNA mã hóa TAA đang được tiến hành.

Một phương pháp hấp dẫn khác là khuếch đại tổng thể mRNA khối u và sử dụng nó để thâm chuyển tổng thể mRNA khối u cũng đóng góp vào hiệu quả của vaccin ung thư.

Sự cần thiết của danger

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra tầm quan trọng của sự hoạt hóa tổng thể DC để có được các đáp ứng nhớ CTL kéo dài in vivo. Như đã được đề cập ở trên, sự hoạt hóa tối ưu của các DC là hết sức thiết yếu để tạo ra một đáp ứng tế bào T kháng u hiệu quả. Nếu một vec tơ được sử dụng để chuyển gen tới các DC mà chưa đạt hiệu quả thì lại đòi hỏi phải có những tín hiệu nguy hiểm (danger) bổ sung.

Việc gắn các phân tử CD40 lên bề mặt DC đã xác định là một tín hiệu quan trọng để mồi hiệu quả các CTL và tạo ra miễn dịch kháng u. CD40 kích hoạt cảm ứng sự chín về chức năng và kiểu hình của các DC và hoàn trả chúng khả năng hoạt hóa CTL, cấp cho các CTL một “giấy phép tiêu diệt” (a liciense to kill). Tầm quan trọng của hiện tượng này đối với việc thải loại hiệu quả khối u đã được khẳng định trong các nghiên cứu in vivo và cho thấy nó phụ thuộc phần lớn vào việc sản xuất IL-12 và điều hòa xuống với một thang rộng các phân tử đồng kích thích (CD86). Vì thế mà CD40L là một ứng cử viên quan trọng gây chín DC trong bất kỳ phương pháp tiêm chủng kháng u nào có liên quan tới DC cải biến gen. 

Các tác nhân khác được dùng đơn lẻ hay kết hợp với CD40 để cảm ứng sự chín đầy đủ của các DC cho hoạt hóa tiếp theo CTL là CpG, GM-CSF, IL-4, RNA chuỗi kép, poly(I:C), LPS, IFN-α và TFN-α. Tổ hợp các tín hiệu danger thường cho các hiệu ứng cộng hay đồng vận về hiệu lực của các vaccin kháng u trong mô hình thải loại khối u trên chuột. Vì thế có nhiều  tín hiệu danger được xem xét áp dụng trong thiết lập các vaccin công nghệ gen. Các gen của chúng có thể được sử dụng trong các vec tơ mã hóa TAA. Điều này sẽ đảm bảo cho việc biểu hiện đồng thời TAA và các tín hiệu danger đúng điểm.

TIÊM CHỦNG VỚI CƠ SỞ DC: ĐƯỜNG VÒNG TRỊ LIỆU MIỄN DỊCH

Hiệu ứng ức chế của DC đối với hoạt hóa miễn dịch ngăn chặn khối u rõ ràng là hiệu quả, nhưng cũng có thể đi theo con đường vòng bằng cách thiết lập vaccin liên quan tới DC tự thân đã chín hoàn toàn, nó có thể trình diện TAA một cách thích đáng và hoạt hóa các tế bào T đặc hiệu khối u. Có 2 cách tiếp cận để đạt được mục đích đó: (1) sản xuất ex vivo, tải TAA và làm chín các DC tự thân và (2) đích in vivo, tải TAA và hoạt hóa các DC định cư ở mô. Những lợi thế cũng như bất lợi của mỗi cách tiếp cận trong tiêm chủng DC dựa trên cơ sở gen TAA sẽ được bàn luận dưới đây.

Ex vivo hay in vivo: trường hợp vaccin công nghệ gen đích bởi DC in vivo

Cách tiếp cận thông thường nhất đối với tiêm chủng kháng u cơ sở DC là sản xuất các DC tự thân in vivo, thường là từ bạch cầu đơn nhân; tiếp theo là tải nạp gen TAA in vitro, cảm ứng chín và chuyển giao adoptive (Hình 9.1A). Cách tiếp cận ex vivo có những lợi thế nhất định như: cho phép kiểm soát hiệu lực tải nạp và trạng thái chín của DC trước khi chúng được phân phối đi, chất lượng vaccin đồng đều. Tải nạp in vitro cũng có thể là cách để phá vỡ bất kỳ đáp ứng kháng thể nào từ trước mà có thể ảnh hưởng tới sự thâm nhiễm của DC bằng các vec tơ virus in vivo.

Ở cách tiếp cận dưới, sản xuất vaccin với cơ sở DC ex vivo ứng dụng trong lâm sàng thì hết sức vất vả và tốn kém. Rõ ràng là cần phải có các điều kiện sản xuất GMP và thường phải làm rõ những điều nghiêm cấm để có thể được thực hiện nhanh chóng trong lâm sàng. Việcònuôi cấy các DC tự thân lý tưởng là môi trường không có huyết thanh để tránh các rủi ro thâm nhiễm và các phản ứng quá mẫn với các thành phần của huyết thanh b . Việc sản xuất các DC trong điều kiện đã loại hết huyết thanh thường cho kết quả biệt hóa DC tối ưu kém hơn vì không có sự biểu hiện CD1a, điều đó có liên quan đến việc làm giảm khả năng kích thích tế bào T. Hơn nữa, vì thường có tới 1-10 triệu DC được phân phối trong một kỳ tiêm chủng, nên muốn làm tăng hiệu ứng miễn dịch thì phải tiêm chủng nhiều lần vì thế mà cần phải nuôi cấy để có một lượng lớn các DC tự thân.

Hình 9.1. Lý thuyết sự chuyển gen đích bởi tế bào tua DC trong tiêm chủng kháng u.  Các kháng nguyên gắn với khối u (TAA) được mã hóa bởi một vec tơ virus (sơ đồ trình diện cũng có thể được áp dụng với các vec to không virus), nó có thể chuyển TAA tới các DC (A) in vitro hoặc (B) và (C) in vivo. (A) tải nạp DC in vitro: các tiền thân DC (bạch cầu đơn nhân CD14⁺) được phân lập từ máu ngoại biên và được nuôi cấy thành các DC. DC được thâm nhiễm bởi vec tơ virus mã hóa TAA và sau đó được gây chín bởi có thêm các tín hiệu nguy ghiểm (danger). Kết quả là DC chín, trình diện các TAA được đưa lại cho bệnh nhân. (B) Đích DC in vivo thông qua sự mồi chéo: các vec tơ virus không được đích mã hóa TAA sẽ được tiêm qua da và chủ yếu sẽ thâm nhiễm nguyên bào sợi ở da. Các nguyên bào sợi được tải nạp sẽ giải phóng ra TAA rồi hỗn hợp lại thành motif đích DC, và các protein tín hiệu nguy hiểm (các sản phẩm chuyển gen được mã hóa bởi virus).  Các DC chưa chín hấp thu một cách chọn lọc TAA đích và dưới ảnh hưởng của các tín hiệu danger sẽ bắt đầu chín.  (C) Đích DC trực tiếp in vivo: cách khác là các vec tơ virus đã cải biến ở mức phân tử đích trực tiếp DC được tiêm trong da và tải nạp chọn lọc các DC chưa chín. Sự tương tác của  các phân tử đích virus có thể được chọn lọc để dẫn tới chín tức thì các DC liên kết mà không cần bổ sung các tín hiệu nguy hiểm. các DC chín trình diện TAA sẽ di rời tới các hạch lympho và hoạt hóa các lymphocyte T độc tế bào đặc hiệu TAA.

(Theo Tanjia D. de Gruijl, Herbert M. Pinedo và Rik J. Scheper. (2005) Cancer Gene  Therapy. Human Press. Totowwa, New Jersey)

Một cách khác đỡ nặng nhọc hơn và có thể ứng dụng dễ dàng hơn là tiêm chủng trực tiếp in vivo cho bệnh nhân các vec tơ virus hoặc không virus mã hóa TAA. Tính khả thi của cách tiếp cận này đã được chứng minh qua các nghiên cứu  về sự thải loại khối u  in vivo trên chuột. Các vaccin dựa trên cơ sở tế bào DC định cư ở mô khai thác các quá trình sinh lý đã được thực hiện để tạo thuận lợi cho hoạt hóa, di trú của DC, trở về các hạch lympho (LN) và hoạt hóa tế bào T tiếp theo. Để trở về các LN và tiếp tục hoạt hóa các tế bào T đặc hiệu, các DC phải phải đạt mức hoạt hóa chuẩn và phô bầy một bộ chuẩn các receptor chemokin, sự biểu hiện phải được dàn dựng chính xác cả về không gian và thời gian. Các DC đã được tạo ra rồi phân phối lại in vitro có thể sẽ không đáp ứng đầy đủ các yêu cầu này. Việc các DC này được hoạt hóa như thế nào để đạt kết quả tối ưu thì vẫn là một vấn đề bàn cãi và vẫn còn nhiều điều chưa rõ.

Đường phân phối cũng là vấn đề cần phải chú trọng hết mức. Tiêm dưới da có lẽ là cách thích hợp nhất để chuyển giao DC, ngay cả khi với số lượng rất thấp các DC được tiêm (thường <1%) là nó đã tới được LN. Bằng cách đích và kích hoạt DC in situ, các đặc trưng sinh lý học của chúng đã được khai thác để thực hiện các chức năng tự nhiên của chúng (trở lại LN, gặp và hoạt hóa các tế bào T đặc hiệu, nâng cao miễn dịch kháng u thông qua sự chiêu mộ thêm các tế bào của hệ miễn dịch bẩm sinh). Vì thế, phân phối trực tiếp các vec tơ mã hóa TAA có thể trình diện được một “off-the-shelf” hấp dẫn hơn, tiêu chuẩn hóa hơn có thể thay thế cho việc tiêm chủng kháng u.

Tải nạp chọn lọc các DC in vivo

Hiệu lực của tiêm chủng vaccin công nghệ gen phụ thuộc vào sự hoạt hóa CTL qua trung gian DC. Về mặt lý thuyết thì thành quả thu được có thể do cả sự tải nạp trực tiếp DC cũng như sự mồi chéo sau tải nạp bạch cầu đơn nhân, các tế bào keratin hay nguyên bào sợi. Cả hai cơ chế này đều đã được chỉ rõ là xảy ra sau khi tiêm chủng vaccin công nghệ gen, nhưng cũng có bằng chứng cho thấy tải nạp trực tiếp DC là đáp ứng chủ yếu để mồi CTL. Khác với các DC, các tế bào cư trú tại mô thì hấp thu rất nhiều vec tơ mã hóa TAA đã được tiêm vào, trong trường hợp này thông thường sẽ có ảnh hưởng tới hiệu ứng tải nạp DC và sự hoạt hóa hiệu ứng CTL. Hơn nữa, sự mồi chéo dưới các điều kiện mà khối u ở trạng thái ổn định thì sẽ đi đến kết quả là cảm ứng dung nạp tế bào T với một hiệu ứng xác định trong tiêm chủng.

Vì thế cần phải phát triển các phương pháp đích DC một cách chọn lọc in vivo, làm như vậy sẽ làm giảm bớt bất kỳ hiệu ứng tế bào nào trên các tế bào người ngoài cuộc và cho phép tăng cường kiểm soát các dạng đáp ứng do tiêm chủng. Có rất nhiều cách tiếp cận để có được sự biểu hiện TAA đích bởi DC:

Các gen TAA trong các vec tơ chuyển giao đã được sử dụng có thể được đặt dưới sự kiểm soát của các promoter đặc hiệu DC hay các enhancer để đảm bảo chắc chắn cho sự phiên mã chọn lọc ở các DC. Một ví dụ về vấn đề này là sử dụng promoter dectin-2 cho trị liệu gen đích bởi LC. Mặc dầu cách tiếp cận này thích hợp cho sự biểu hiện các gen chuyển đặc hiệu DC nhưng nó không nâng cao được hiệu ứng tải nạp in situ của các DC.

Các vec tơ được thiết kế để mã hóa TAA sao cho có thể h a được vào các ligand tự nhiên của các receptor đặc hiệu DC. Điều này sẽ nâng cao đáng kể sự hấp thu TAA bởi các DC cho sự mồi chéo (phác thảo ở Hình 9.1B). Trong cách tiếp cận này điều thiết yếu là phải thiết kế vaccin như thế nào để cung cấp được các tín hiệu nguy hiểm để tránh sự dung nạp hóa chéo. Điều này có thể đạt được thông qua việc phân phối đồng thời nhưng tách biệt các tác nhân gây tiền viêm hoặc bằng cách gộp thêm các gen nguy hiểm (CD40L hoặc GM-CSF) trong vec tơ. Các kháng nguyên đã được h a trước vào các CTLA-4, CCL21, các đoạn Fc hoặc các gốc  manosylate hóa để đích chúng tới các receptor trên DC. Các kháng nguyên được mã hóa bởi  DNA plasmid được h a vào CTLA-4 hoặc FLT3 và CD40L cũng được mô tả là làm tăng kháng thể và miễn dịch qua trung gian CTL.

Một cách khác là, có thể sử dụng các vec tơ đích bởi DC để tăng tải nạp DC trực tiếp in situ. Một số vec tơ virus (lentivirus hay SFV) có khả năng đích DC tự nhiên, nhưng hầu hết đều phải biến đổi gen hoặc được phức hợp với các chất bổ trợ miễn dịch thì mới đích DC chọn lọc (Hình 9.1C). Việc đích có thể qua trung gian các ligand tự nhiên của các receptor gắn DC hoặc các kháng thể đặc hiệu DC. Cả vec tơ virus và không virus đều có thể đích DC bằng cách phức hợp với kháng thể hoặc chất bổ trợ manose polyethylenimin.  Đích miễn dịch protein kháng nguyên tới các APC không cần phải thêm chất bổ trợ cho việc cảm ứng miễn dịch thể dịch in vivo nhờ sử dụng các phân tử đích như MHC-II và FcR. Nếu đích tới nhiều marker giới hạn của DC (CD11c) thì cảm ứng đáp ứng mạnh hơn.

Điều quan trọng cần phải ghi nhớ là việc đích DC đơn lẻ là chưa đủ mà cần phải có sự hoạt hóa bổ sung. Hawiger và cộng sự đã chỉ rõ rằng việc đích một mẫu kháng nguyên tới tới receptor DEC-205 trên các DC chuột sẽ dẫn đến dập tắt đáp ứng tế bào T trong vòng 7 ngày sau tiêm chủng. Sự mất đáp ứng này có thể được khắc phụcònếu tiêm đồng thời với một kháng thể chủ vận CD40. Các vec tơ adenovirus tái đích DC thông qua một chất bổ trợ miễn dịch gắn CD40 đã tải nạp chọn lọc các DC của da in situ, đồng thời lại cảm ứng gây chín. Những chiến lược đích như thế có thể đảm bảo cả việc tải nạp đặc hiệu DC cũng như hoạt hóa DC thích hợp để mồi miễn dịch kháng u.

Đích các phân tử cho tải nạp và hoạt hóa DC in situ

Những  phân tử nào có khả năng đích sự chuyển gen đặc hiệu DC ?  Trả lời câu hỏi này liên quan mật thiết tới nhiều vấn đề như tiểu quần thể, trạng thái chín  và sự định vị giải phẫu của DC được đích. Nhiều ứng cử viên có khả năng đã được thống kê ở đây. Những đích hấp dẫn nhất sẽ là (1) chỉ biểu hiện trên các DC, (2) h a đồng nhanh chóng trong việc liên kết, (3) con đường h a đồng các kháng nguyên nằm trong các con đường xử lý của MHC lớp I và II và (4) cảm ứng sự chín và sự di trú DC ở trạng thái liên kết để cho phép hoạt hóa CTL đạt mức tối ưu.

Mô hình nhận dạng và các receptor bắt giữ kháng nguyên là các đích hấp dẫn bởi vì nó là chức năng tự nhiên của chúng để h a nhập kháng nguyên và làm trung gian cho các con đường xử lý kháng nguyên. Hơn nữa, những biểu hiện của biệt hóa trên các tiểu quần thể DC có thể cho phép đích đặc hiệu các tiểu quần thể như: LC  với langerin, DDC với MR, DEC-205, TLR2, TLR4, DC-SIGN; PDC với  BDCA2, TLR7 và TLR9. Các kháng nguyên được h a bởi MR, DEC-205 và DC-SIGN được chỉ rõ là được trình diện tới các phân tử MHC lớp II của các CD4⁺.  β2- Defensin - một ligand peptide của TLR4 đã h a vào cùng các kháng nguyên để đích DC  và nâng cao miễn dịch tế bào T type 1.

Các phân tử CD1 có liên quan tới sự trình diện kháng nguyên của các glycolipid cũng có thể là mục tiêu thích hợp cho việc đích các LC (CD1a) hoặc DDC (CD1b và CD1d) bởi vì các tiểu quần thể này có biểu hiện biệt hóa.

Tuy vậy, sự biểu hiện của chúng không chỉ hạn chế với DC, FcR cũng là một ứng cử viên hấp dẫn bởi vì chúng có thể hướng một cách hiệu quả các kháng nguyên tới cả con đường xử lý của MHC lớp I và lớp II. Sự biểu hiện của FcR có thể khác nhau giữa các tiểu quần thể DC cũng như giữa các trạng thái chín. Sự chín DC qua trung gian FcR đã được báo cáo là có thể làm tăng hiệu quả của vaccin.

Các thành viên của siêu họ TNF và TNFR là các ứng cử viên đích DC đặc biệt hấp dẫn. Do liên kết đồng thuận và bắt chéo nên chúng có thể hoạt hóa được các con đường tín hiệu nội bào ở các DC, dẫn đến cảm ứng chín phụ thuộc nF-kB (CD40, Fas, Decoy rector-3 [LIGHT ligand]  và 4-1BB), sự di trú tới các LN (CD40L và RANK) và tăng thời gian sống sót (RANK). Sự hấp thu TAA qua trung gian Fas từ các khối u FasL⁺ đã được khảo sát và sự tải nạp adenovirus qua trung gian CD40 đã cho kết quả làm tăng sự chín DC và sự hoạt hóa CTL đặc hiệu. Tuy vậy, sự biểu hiện của các thành viên siêu họ TNF và TNFR cũng không bị giới hạn với các DC, sự biểu hiện của chúng trên các DC ở các mô không phải lympho ngoại biên có thể đủ cao và đặc hiệu cho phép tải nạp DC với sự chọn lọc cao.

Các receptor HSP (CD9) và các receptor gắn với các đoạn apoptotic (α_vβ₃ và   α_vβ₅ integrin) cũng có thể là các mẫu (motif) đích hữu dụng có tiềm năng hoạt hóa DC. Thực vậy, các motif RGD đích các vec tơ Ad tới α_vβ₃ và α_vβ₅ integrin đã làm tăng sự hoạt hóa DC. Các thể apoptotic được xác định là các phương tiện vận chuyển kháng nguyên thích hợp cho việc đích DC in vivo. 

Cd72- một ligand của semaphoring CD100 cũng có thể được coi như một motif đích kháng nguyên có các đặc tính hoạt hóa DC bởi vì CD100 hòa tan có thể cảm ứng sự chín và tiếp tục tăng cường quá trình mồi tế bào T qua trung gian DC.

CD83, CCR7 và CMRF-44 có thể cung cấp các motif để đích đặc hiệu các DC chín. Tuy nhiên, sự h a nhập vec tơ có thể bị suy yếu ở các DC chín hoàn toàn và khả năng của chúng đối với việc xử lý các kháng nguyên để trình diện tới các tế bào T cũng bị yếu đi.

Vì sự biệt hóa ở ung thư thường bị “quấy rầy” nên cách hiệu ứng nhất của DC là đích cho trị liệu khối u in vivo thông qua các marker tiền thân như CD14, CD1c, BDCA-3 và CD11c. Một phần cuả cách tiếp cận này là sau đó gộp thêm các cytokin hoặc các vec tơ mang các mã di truyền của chúng để kích thích sự biệt hóa và sự chín của các tiền thân DC đã được tải nạp.

Sự biểu hiện của các phân tử này trên các DC có thể là khác nhau giữa các tiểu quần thể, các giai đoạn phát triển, các dạng mô và các trạng thái của bệnh, nhưng nó có thể được điều chỉnh bằng việc xử lý với cytokin. Chẳng hạn như việc chuyển giao adenovirus đích bởi CD40 tới các DC của da in situ đòi hỏi phải cảm ứng trước khi chín bằng cách tiêm trong da GM-CSF và hoặc interleukin. Cần phải lưu ý rằng sự điều chỉnh trạng thái hoạt hóa DC như thế sẽ không làm ảnh hưởng tới khả năng hấp thu và xử lý kháng nguyên của các DC cho sự hoạt hóa tế bào T kế tiếp. Động học của sự liên kết vec tơ, sự hấp thu, biểu hiện và xử lý TAA và sự hoạt hóa, di trú của DC phải đúng thời điểm thì mới cho phép sản sinh được các đáp ứng tế bào T đặc hiệu TAA một cách tối ưu.

TIẾN BỘ LÂM SÀNG: NHỮNG BƯỚC ĐI KHIÊM TỐN

Các MoDC tự thân được sản xuất in vitro tải các peptid, protein bắt nguồn từ TAA hoặc các chất ly giải của khối u đã sử dụng thành công trong các thử nghiệm lâm sàng và cho thấy là an toàn. Không thấy độc tính hay các hiệu ứng phụ nghiêm trọng nào và một số đấp ứng lâm sàng đã được báo cáo ở các bệnh nhân ung thư giai đoạn muộn được tiêm vaccin một cách chọn lọc. Các thử nghiệm lâm sàng pha II đã chứng minh chắc chắn về hiệu lực lâm sàng của các chiến lược vaccin với cơ sở DC, nhưng những cách tiếp cận với DC cải biến di truyền thì vẫn còn ì ạch. Cũng cần phải chứng minh khả năng nâng cao hiệu lực của các DC tải protein và các vấn đề thuộc về an toàn cũng phải được giải quyết trước khi trị liệu miễn dịch ung thư với cơ sở DC có thể đi tới lâm sàng.

Các thử nghiệm lâm sàng quá khứ và hiện tại

Những báo cáo về các TNLS liên quan tới việc sử dụng các DC cải biến gen cho bệnh nhân ung thư rất hiếm hoi. Mặc dầu có nhiều thử nghiệm pha I/II đã được thực hiện về việc thăm d  tiêm chủng TAA dựa trên cơ sở VV, nó luôn được đưa trực tiếp vào cơ thể in vivo bằng cách rạch trên da, tiêm trong da, dưới da hay trong cơ, nhưng chưa bao giờ qua tải nạp DC tự thân in vitro. Những bệnh nhân ung thư giai đoạn muộn nên tiêm chủng với VV hay các vec tơ avipox (đôi khi cả với protocol mồi/khuyến khích) mã hóa cho các kháng nguyên ung thư phôi mucin-1, kháng nguyên đặc hiệu tuyến tiền liệt (PSA) hoặc HPV E6 và E7. Mặc dầu không có các độc tính nghiêm trọng hoặc các vấn đề về an toàn, nhưng hiệu ứng đáp ứng CTL và đáp ứng kháng thể đặc hiệu TAA vẫn còn rất thấp hoặc không thấy có, và chưa có đáp ứng lâm sàng nào quan sát thấy. Điều này có thể do sự dung nạp quá mạnh hoặc do các đáp ứng kháng thể đã có từ trước với VV (có thể được thúc đẩy một cách tình cờ do tiêm chủng). Tuy nhiên, nếu phối hợp GM-CSF với B7.1 trong công thức vaccin thì mới chỉ  có thể làm tăng nhẹ các phản ứng miễn dịch đặc hiệu TAA. Hình ảnh in vivo trên kính hiển vi đồng tiêu điểm  cho thấy các DC thâm nhiễm đã đáp ứng với sự mồi CTL ở các LN. Tuy nhiên, như chúng ta biết vì các VV ảnh hưởng tới sự chín của DCònên nó cũng không cho được hiệu ứng cao. Cảm ứng sự chín DC trước khi tải nạp (in vivo hoặc in vtro) có thể nâng cao được hiệu lực của các vaccin kháng u với cơ sở VV. 

Các nghiên cứu lâm sàng về tiêm chủng cho các bệnh nhân ung thư đã di căn với các vec tơ adenovirus mã hóa p53, MART-1 hoặc GP100 thấy không gây được cảm ứng đáp ứng miễn dịch đặc hiệu hoặc đáp ứng lâm sàng. Một lần nữa cho thấy những đáp ứng kháng thể trung h a cấm kỵ đã được tạo ra là lời giải thích về hiệu lực nghèo nàn của vaccin. Các thử nghiệm lâm sàng nghiên cứu  hiệu lực của tiêm chủng với MoDC thâm nhiễm bởi adenovirus tự thân hiện nay đang được tiến hành.

Mặc dầu việc tiêm chủng DNA không bị ngăn trở miễn dịch bởi các miễn dịch đã có từ trước nhưng lại thấy nó cũng không có hiệu quả trong việc tạo ra miễn dịch đặc hiệu kháng nguyên, có khả năng là do hiệu quả tải nạp in vivo của các DC là nghèo nàn. Tuy nhiên lại thấy tăng các phản ứng quá mẫn muộn và đáp ứng với CTL sau khi tiêm chủng MoDC đã được thâm chuyển in vitro với MUC1 mã hóa cho DNA bổ thể.

Báo cáo hy vọng nhất là của Heiser và cộng sự cho thấy có tăng một cách hợp lý các đáp ứng tế bào T đặc hiệu sau khi tiêm chủng với các DC tự thân được thâm chuyển với mRNA  mã hóa PSA. Hiệu lực kháng u rất cao là do giảm tốc độ tăng PSA huyết tương và giảm tạm thời các tế bào khối u đang lưu thông (được phát hiện bằng các biện pháp phân tử). Một nhóm nghiên cứu tương tự đang test việc sử dụng RNA toàn khối u cho việc thâm chuyển DC và sau đó tiêm chủng cho các bệnh nhân ung thư tế bào thận (renal cell cancer-RCC) đã di căn. Những số liệu hứa hẹn đầu tiên đã chỉ rõ rằng sau khi tiêm chủng đã có các đáp ứng tế bào T kháng lại các TAA khác nhau. 

Các TNLS đáng kể hơn đã khảo sát khả năng tiêm chủng cho các bệnh nhân ung thư với các tế bào khối u dị loại hay tự thân biểu hiện các cytokin kích thích DC như IL-4 và thông thường nhất là GM-CSF. Những tế bào tự thân từ u sắc tố, ung thư tuyến tiền liệt, RCC hay các khối u tụy đã được tải nạp bằng các vec tơ virus (adeno hoặc retrovirus) hoặc được thâm chuyển bằng DNA plasmid để biểu hiện GM-CSF trước khi chúng được đưa vào các bệnh nhân ung thư. Phương pháp này cho thấy trong một số trường hợp riêng biệt có làm tăng đáp ứng quá mẫn muộn và đáp ứng CTL đặc hiệu khối u và thời gian sống sót không bệnh tức là có đáp ứng phần nào về lâm sàng. Những quan sát tương tự về các vaccin kháng u tải nạp GM-CSF tự thân đã vạch rõ vai trò  chính của sự bắt mồi chéo  bởi các DC (tự thân) trong cách tiếp cận này. Những số liệu đáng khích lệ này từ các thử nghiệm pha I/II đã đảm bảo chắc chắn cho các nghiên cứu lâm sàng xa hơn.

Những vấn đề tồn tại và các định hướng tương lai

Mặc dầu việc tiêm chủng với gen TAA cùng với các DC cải biến gen đã đem lại những hy vọng lớn lao nhưng vẫn còn những trở ngại cần phải vượt qua trước khi phương pháp trị liệu này có thể được áp dụng rộng rãi trong lâm sàng, cũng cần phải xem xét một cách rành mạch về các vấn đề an toàn, việc sử dụng các DC cải biến gen phải được biện minh bởi hiệu quả vượt trội của nó hơn hẳn các DC được xung điện với các protein (protein-pulsed DC). So sánh trực tiếp giữa các phương pháp tiêm chủng khác nhau phải được thực hiện chặt chẽ hơn trong các thiết kế tiền lâm sàng trước khi các phương pháp triển vọng nhất có thể được test trong các TNLS.

Tương tự như vậy, các vec tơ virus ứng cử viên cũng phải được so sánh cẩn thận hơn in vitro về khả năng của chúng đối với việc cảm ứng các tế bào T kháng u và sự loại thải khối u. Vấn đề đáp ứng miễn dịch trội đã có từ trước kháng lại các vec tơ virus mà có thể ảnh hưởng tới sự thâm nhiễm virus và mồi hiệu quả miễn dịch đặc hiệu TAA cũng cần được giải quyết hoặc bằng các thế hệ vec tơ tiên tiến, tính sinh miễn dịch thấp hoặc bằng các protocol mồi/khuyến khích  tối ưu với các hệ vec tơ khác nhau.

Một vấn đề quan trọng khác cần phải được giải quyết  là lựa chọn các gen TAA để chuyển tới các DC. Để tránh sự phát triển các biến thể lẩn tránh khối u thì phải tiêm nhiều gen TAA. Lý tưởng là nên phát triển việc tiêm chủng với nền tảng DC cải biến gen với một bảng chuẩn các TAA thông thường biểu hiện ở các khối u nhưng không biểu hiện ở các mô bình thường. Nếu muốn chuyển gen TAA đích thành công in vivo thì có rất nhiều vấn đề phải quan tâm một cách thích đáng như các tiểu quần thể DCònào dùng để đích và bộ phận nào của cơ thể mà các phân tử đích chọn lọc và những chất bổ trợ miễn dịch nào được thêm vào, con đường xử lý kháng nguyên nào được đích và thời gian tối ưu của sự hoạt hóa DC và chuyển giao vec tơ để cho sự hoạt hóa CTL có hiệu quả. Cuối cùng mọi người đều đồng thuận rằng để trị liệu miễn dịch có hiệu quả thì phải có sự bổ trợ của các yếu tố khác nữa. Các protocol điều trị tối ưu cần phải đảm bảo chắc chắn cácònét đặc sắc của trị liệu gen miễn dịch đồng thời phải kết hợp cùng các phương pháp khác để đạt được các hiệu ứng đồng vận kháng u.

Vấn đề lớn vẫn còn tồn tại là vẫn còn một bảng liệt kê dài các trở ngại của việc trị liệu xung quanh vấn đề làm thế nào để phá vỡ được sự dung nạp miễn dịch liên quan tới khối u. Nói cách khác là việc triển khai DC trong cuộc đấu tranh chống lại ung thư như thế nào là tốt nhất để chúng có thể như là tiếng chuông cảnh tỉnh cho tất cả các thành viên, cả bẩm sinh lẫn thích ứng đối với đáp ứng miễn dịch kháng u hiệu quả. Dường như tất cả đều nhất trí rằng DC có thể là vũ khí tốt nhất của chúng ta cho tới thời điểm này.